垂葛酒肝丸質(zhì)量標準研究*

王 剛 ，陳向東 △，羅海龍 ，李永佳 ，李敏清

（1．四川省達州市中心醫(yī)院，四川 達州 635000； 2．成都地奧集團天府藥業(yè)股份有限公司，四川 達州 635000）

垂葛酒肝丸是達州市中心醫(yī)院名中醫(yī)經(jīng)驗方，由葛根、丹參、山楂、澤瀉、垂盆草等11味中藥組方，具有清解酒毒、除濕祛痰、行氣逐瘀、保護肝臟細胞、降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，臨床用于治療脂肪肝有顯著療效[1]。為保證制劑質(zhì)量和療效的穩(wěn)定性，本研究中用薄層色譜（TLC）法對垂葛酒肝丸中的丹參、山楂、澤瀉分別進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定葛根中葛根素的含量，對該制劑的質(zhì)量控制和評價提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1260型液相色譜儀（美國安捷倫＜中國＞有限公司）；CPA225D型電子天平（美國賽多利斯公司）；AS10200BDT型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；TU-1810型紫外分光光度計（北京普析分析儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1．2 試藥

丹參酮ⅡA對照品（批號為110766-201520），熊果酸對照品（批號為 110742-200517），23-乙酰澤瀉醇B對照品（批號為111846-201504），葛根素對照品（批號為110752-201615，供含量測定用），均由中國食品藥品檢定研究院提供；垂葛酒肝丸 (批號分別為161203，170216，170321)，缺葛根、丹參、山楂、澤瀉的陰性樣品，均由達州市中心醫(yī)院提供；水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 TLC 鑒別

丹參：取本品 3 g，研細，加甲醇 10 mL，超聲處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液。另取丹參酮ⅡA對照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液作為對照品溶液。取不含丹參的陰性樣品3 g，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典(四部)》(通則0502）方法試驗，吸取上述 3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯 -乙酸乙酯 -甲醇 -甲酸（6∶4∶8∶1∶4）為展開劑，展開至約4 cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1A。

山楂：取本品2 g，研細，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理20 min，取濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取不含山楂的陰性樣品2 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典(四部)》（通則0502）薄層色譜法試驗，吸取溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 -甲酸（20 ∶4 ∶0．5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液（3→10），在80℃加熱3 min，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1B。

澤瀉：取本品3 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液置水浴上濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取23-乙酰澤瀉醇B對照品，加甲醇制成每1 mL含0．2 mg的對照品溶液。取不含澤瀉的陰性樣品3 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典(四部)》（通則0502）薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮（4∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，用0．5%香草醛硫酸-乙醇（4∶1）溶液噴霧顯色。在105℃加熱至斑點清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，色譜圖見圖1C。

圖1 薄層色譜圖

2．2 葛根素含量測定

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：賽分 C18-H 柱 （250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（25∶75）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL ／min；檢測波長：250 nm。在此色譜條件下，葛根素和樣品中其他組分色譜峰可基線分離，葛根素與其相鄰色譜峰的分離度符合要求。按葛根素色譜峰計算，理論板數(shù)不低于4 000，拖尾因子符合要求。色譜圖見圖2。

2．2．2 溶液制備

取樣品 10 g，研細，取約 1 g，精密稱定，置 100 mL具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得供試品溶液；稱取干燥至恒重的葛根素對照品2．558 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0．025 6 g／L葛根素對照品溶液。取不含葛根的陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法制得缺葛根的陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學考察

陰性干擾試驗：精密吸取 2．2．2項下3種溶液各10 μL，依次進樣測定。供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，陰性對照品則無此色譜峰，表明陰性對照無干擾，目標峰與相鄰色譜峰分離度均大于1．5。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取對照品溶液（質(zhì)量濃度為0．025 6 g ／L）1．0，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液，分別進樣 10 μL，測定峰面積，記錄色譜圖，以峰面積值(Y)為縱坐標，對照品進樣量（μg，X）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝424 217 X-13 763，r＝0．999 5（n＝6）。結(jié)果表明，葛根素進樣量在0．025 6 ～0．153 6 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（n＝6）。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液（質(zhì)量濃度為0．025 6 g ／L）、供試品溶液各 10 μL，重復(fù)進樣，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0．88%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取葛根素對照品溶液（質(zhì)量濃度為0．025 6 g ／L）及供試品溶液分別于不同時間 0，2，4，6，8，10 h時進樣各10 μL，測定峰面積值。結(jié)果的 RSD為0．40%（n＝6），表明對照品溶液與供試品溶液均在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：按擬訂含量測定方法，取同一批樣品5份，分別制成供試品溶液，測定含量。結(jié)果平均含量為 0．265 7 mg／g，RSD 為 0．21% （n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取 6份已知含量（0．27 mg／g）的樣品約1．0 g，分別加入葛根素對照品溶液（質(zhì)量濃度為0．127 9 g ／L）2 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定含量。結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結(jié)果(n＝6)

2．2．4 樣品含量測定

取本品，按照擬訂的含量測定方法，測得3批(批號分別為 20161203，20170216，20170321)樣品葛根素含量分別為 0．27，0．25，0．19 mg／g(n ＝ 3)。

3 討論

有效成分選擇：垂葛酒肝丸中的葛根，味甘、辛，性涼，具有解肌退熱、生津止渴、解酒毒等功效，藥理及臨床研究證明，可有效拮抗酒精導(dǎo)致的睪丸和肝組織脂質(zhì)的過氧化損害，具有良好的解酒作用[2]；丹參活血祛瘀；山楂行氣散瘀，化濁降脂，具有降血壓、調(diào)血脂、降血糖等作用[3-4]；澤瀉利水滲濕，泄熱，化濁降脂，顯著改善肝臟脂質(zhì)沉積，具有很好的保肝作用[5]。故上述藥物檢測可保證制劑中的藥物有效成分的質(zhì)量控制。

TLC鑒別條件選擇：通過對丹參、山楂、澤瀉的薄層色譜方法[6-9]研究比較，并參照2015年版《中國藥典(一部)》丹參、山楂鑒別項下方法[10]，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。澤瀉鑒別采用藥典方法[10]，不能得到理想圖譜，澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B以甲醇提取收得率高，雜質(zhì)含量少[11]。改用甲醇提取，在硅膠GF254薄層板上用環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮（4∶2∶1）為展開劑[12]，展開，分離效果滿意，斑點清晰，陰性對照無干擾，可作為本品的TLC鑒別系統(tǒng)。

HPLC條件選擇：通過對提取溶劑、方法、時間的考察，并參考文獻[13-15]，確定了葛根素含量測定中，制備供試品溶液的方法。葛根素的脂溶性和水溶性較差，可溶于甲醇、乙醇[16-17]，故對甲醇、乙醇、30%乙醇進行考察。取樣品適量，精密稱定，分別精密加入甲醇、乙醇、30%乙醇，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，再稱定質(zhì)量，用上述溶液分別補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進樣測定，葛根素在甲醇和乙醇中未分離，在30%乙醇中測得葛根素含量為 0．27 mg／g。

樣品處理方法選擇：葛根素常用提取方法有浸漬、超聲、回流[17]等，但浸漬耗時太長，僅考察超聲和回流提取。經(jīng)考察，超聲提取30 min以上，測得樣品中葛根素的含量不再增加。故采用30%乙醇提取30 min制備供試品溶液。按處方藥味比例，自配不含葛根的陰性對照品，結(jié)果液相色譜中陰性對照品溶液在與對照品溶液相同保留時間處未顯色譜峰，表明陰性無干擾，說明本方法準確可靠、可行。

綜上所述，本試驗中建立的鑒別丹參、山楂、澤瀉的TLC法，可有效鑒別其特征性斑點，可作為該制劑的定性控制方法；建立的測定葛根素含量的HPLC法，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性符合要求，可作為該制劑的定量控制方法。上述兩種方法為制訂垂葛酒肝丸的質(zhì)量標準提供了理論依據(jù)。

：

[1]王 剛，王海濤，李敏清，等．垂葛酒肝丸治療酒精性脂肪肝療效觀察[J]．中外健康文摘，2013(7)：17-18．

[2]周吉銀，周世文．葛根總黃酮及葛根素解酒的藥理研究進展[J]．中國醫(yī)院藥學雜志，2007，27(9)：1280-1282．

[3]袁 媛，吳 芹，石京山，等．丹參及其主要成分保肝作用的研究進展[J]．中國中藥雜志，2015，40(4)：588-593．

[4]李建華，胡金林．山楂的藥理作用與臨床應(yīng)用[J]．中國藥物濫用防治雜志，2011，17(6)：334-336．

[5]王建平，傅旭春．澤瀉的化學成分和藥理作用研究進展[J]．浙江醫(yī)學，2012，34(14)：1235-1237．

[6]謝瑞萍．復(fù)方七參片的薄層色譜鑒別[J]．云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31(7)：69-70．

[7]趙玉華，崔曉娟，樊 萍，等．丹參葛根對藥不同提取方法薄層特征比較研究[J]．中醫(yī)藥臨床雜志，2011，23(10)：900-901．

[8]黃超華，吳 杰，駱妃靜．山楂中熊果酸的提取與分離[J]．西北藥學雜志，2009，24(6)：459-460．

[9]谷春霞．益肝散中丹參和川芎的薄層色譜鑒別[J]．北方藥學，2014，11(4)：13-14．

[10]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：31，76-77，229．

[11]王立新，吳啟南，彭國平．澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量測定研究[J]．南京中醫(yī)藥大學學報(自然科學版)，2002，18(2)：105-107．

[12]鞏麗萍，王少云，侯 準，等．澤瀉薄層色譜鑒別研究[J]．中國中藥雜志，2006，31(19)：1628-1629．

[13]劉海容．葛根清腸顆粒質(zhì)量控制方法研究[J]．中國藥業(yè)，2011，20(11)：28-29．

[14]楊峰亮，湯穎斐，虞和永．HPLC測定十味玉泉膠囊中葛根素的含量[J]．中國中藥雜志，2011，36(5)：576-577．

[15]張伏軍，須 建，尹小玲．益陰消渴滴丸質(zhì)量標準研究[J]．中國藥業(yè)，2014，23(14)：51-52．

[16]吳 晶，高 星，張 瑜，等．葛根素結(jié)構(gòu)改造研究進展[J]．中國藥物警戒，2011，8(12)：741-743．

[17]張 彤，徐蓮英，陶建生，等．多指標綜合評分法優(yōu)選葛根提取工藝[J]．中草藥，2004，35(1)：38-40．