高原鼢鼠微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)篩選及其通用性檢測(cè)

康宇坤，張德罡，譚宇塵，王海芳，蔡卓山，蘇軍虎(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； .甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)-新西蘭梅西大學(xué)草地生物多樣性研究中心，甘肅 蘭州 730070；)

微衛(wèi)星(Microsatellite)DNA，是以2～6個(gè)堿基序列為核心單位，串聯(lián)排列的核苷酸序列，廣泛存在真核生物的基因組中[1]。由于操作難度低，包含信息豐富，在相關(guān)領(lǐng)域被學(xué)者們作為首選標(biāo)記，廣泛運(yùn)用。尤其在物種分化、遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和資源保護(hù)利用管理中運(yùn)用很廣[2-3]。由于微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)位置處在重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列，因此，相較于其他各種遺傳標(biāo)記的方法，進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記時(shí)，獲得其位點(diǎn)的序列信息是前提[4]。之后的首要步驟，就是對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行篩選。針對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的發(fā)掘，方式眾多，隨著科技發(fā)展，最早的分離法已較少運(yùn)用，各種富集法漸漸出現(xiàn)，使操作變繁為簡(jiǎn)，大大增加工作效率[4]?？绶N擴(kuò)增及其通用性檢測(cè)是利用微衛(wèi)星位點(diǎn)在親緣關(guān)系較近的物種中具有保守性的特點(diǎn)，在其他物種信息的基礎(chǔ)上，快速、高效的一種方法，已在部分研究中顯示出了極大價(jià)值[5-7]。

高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)隸屬嚙齒目(Rodentia)，鼴形鼠科(Spalacidae)，鼢鼠亞科(Myospalactinae)，凸顱鼢鼠屬(Eospalax)[8-9]，是分布于青藏高原的特有物種，為高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中的固有成員，正常情況下，對(duì)草地適度的啃食對(duì)其生態(tài)系統(tǒng)有利，對(duì)整個(gè)草地生態(tài)環(huán)境起到了不可替代的重要作用[10]，作為草地生物多樣性的組成部分之一，其在草地生態(tài)系統(tǒng)具有特殊的地位，對(duì)于能量流通和物質(zhì)循環(huán)有重要作用[11-12]，享有“生態(tài)系統(tǒng)工程師”的美譽(yù)[13]。隨著人類(lèi)活動(dòng)的影響，草地退化越來(lái)越嚴(yán)重，致使水土流失，生物多樣性越來(lái)越少，生態(tài)安全面臨嚴(yán)峻的形勢(shì)[14]，也使得草地管理利用問(wèn)題更加突出[15]。高原鼢鼠物種演化歷史漫長(zhǎng)，生活方式特殊，生態(tài)作用重要，因此相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者對(duì)高原鼢鼠產(chǎn)生了濃厚興趣[16-17]。然而，高原鼢鼠特有的地下生活方式，加之趨同、平行進(jìn)化等影響，使得有關(guān)該物種的分類(lèi)、生態(tài)等相關(guān)知識(shí)不足，亟需利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行補(bǔ)充佐證。高原鼢鼠多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的獲得對(duì)開(kāi)展有關(guān)高原鼢鼠的行為生態(tài)學(xué)、分子生態(tài)學(xué)和種群遺傳學(xué)相關(guān)研究，彌補(bǔ)傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)研究具有重要的意義。通過(guò)提取不同地區(qū)高原鼢鼠種群DNA，候選鼴形鼠科(Spalacidae)和近緣種甘肅鼢鼠(Eospalaxcansus)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，在高原鼢鼠中進(jìn)行PCR擴(kuò)增及其多態(tài)性檢測(cè)，旨在為高原鼢鼠的分子遺傳生態(tài)方面的研究和高原鼢鼠高效科學(xué)的管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物于2015年3～7月，采集于甘肅省省內(nèi)現(xiàn)有分布地天祝、瑪曲、碌曲等。麻醉，血液采集完畢后并處死，同時(shí)解剖，取出肝臟組織，完成之后，用濃度為95%的乙醇保存，并將冰箱冷凍室溫度調(diào)節(jié)至-70℃，將組織樣本放入保存。參考類(lèi)似研究[8]，和標(biāo)本一一對(duì)照，根據(jù)特征進(jìn)行物種的鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取與檢測(cè) 取0.3 g 新鮮的鼢鼠肝臟組織，按照常規(guī)的酚/氯仿抽提基因組DNA[18]。取2 μL總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組。

1.2.2 SSR 引物的篩選及擴(kuò)增 從同科的鼴鼠(Spalaxehrenbergi)的27對(duì)[19]，和同屬的甘肅鼢鼠的引物中選取60對(duì)，共87對(duì)[20]，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成合成工作。采用高原鼢鼠混合DNA 池作為模板來(lái)進(jìn)行微衛(wèi)星引物的摸索條件和擴(kuò)增梯度工作，將引物的最優(yōu)復(fù)性溫度和可用于高原鼢鼠的微衛(wèi)星分析引物進(jìn)行確定。

PCR 反應(yīng)體系總體積25 μL，其組成為10×PCRbuffer 2.5 μL，10 mmol/L 4×dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL上下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶1 U，50 ng/μL DNA 模板1 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，適宜的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 次，72℃繼續(xù)延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析 電泳步驟與方法： 制膠(8.25 mL 30%貯液，11.75蒸餾水，5 mL的5×TBE，0.2 mL)、倒膠、點(diǎn)樣、進(jìn)行電泳、染色(先固定在染色最后顯色)、制膜保存，最后觀察分析。電泳程序?yàn)槭紫?0W預(yù)電泳30 min，點(diǎn)樣后50 W電泳4～5 h[21]。待膠板自然干燥后，用Epson V30掃描儀掃描膠。掃描圖像中，各位點(diǎn)等位基因的大小范圍以及最終數(shù)據(jù)的格式轉(zhuǎn)換工作均在Excel Microsatellite Tookit V3.1中進(jìn)行。3個(gè)群體中，各微衛(wèi)星位點(diǎn)中的5組數(shù)據(jù)計(jì)算工作在Popgene 1.31中完成，其中，包括多態(tài)信息含量(PIC)[22]、等位基因數(shù)(a)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)[23]以及有效等位基因數(shù)(Ne)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物的篩選與擴(kuò)增

篩選了鼴鼠的27對(duì)微衛(wèi)星引物，甘肅鼢鼠的60對(duì)微衛(wèi)星引物，以隨機(jī)混合的基因組DNA池為模板進(jìn)行篩選。經(jīng)過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，87對(duì)引物中，PCR成功擴(kuò)增了54對(duì)，其中鼴鼠的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增率較低，僅有17對(duì)具有穩(wěn)定的條帶，但其中有部分位點(diǎn)條帶多，不易區(qū)分，全表現(xiàn)為單態(tài)。甘肅鼢鼠中有43對(duì)擴(kuò)增成功，但只有9對(duì)引物的擴(kuò)增片段有較穩(wěn)定的多態(tài)性，其余都表現(xiàn)為單態(tài)，部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 部分位點(diǎn)的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis patterns of some loci in Eospalax baileyi注：圖中1～7分別是不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)

2.2 微衛(wèi)星擴(kuò)增圖譜的分析

通過(guò)分析高原鼢鼠中9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增圖譜，發(fā)現(xiàn)在諸如無(wú)論是否進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)論等位基因長(zhǎng)度分布范圍如何和無(wú)論各位點(diǎn)擴(kuò)增的等位基因數(shù)量為多少等相關(guān)問(wèn)題上，不同種之間存有差異。在等位基因長(zhǎng)度分布范圍方面，鼴形鼠、甘肅鼢鼠和高原鼢鼠等位基因大小范圍有明顯的區(qū)別。ECT21 位點(diǎn)上，高原鼢鼠的等位基因大小為190～220 bp，明顯大于該位點(diǎn)上甘肅鼢鼠的擴(kuò)增片段。此外，甘肅鼢鼠與高原鼢鼠在ECT110位點(diǎn)上擴(kuò)增片段的大小不同，同時(shí)對(duì)EBGA16、EBGA54位點(diǎn)上的擴(kuò)增片段大小進(jìn)行比對(duì)后，結(jié)果表明甘肅鼢鼠與高原鼢鼠同樣存在差異(圖2)。分析各微衛(wèi)星位點(diǎn)所得到的等位基因數(shù)，結(jié)果顯示差異同樣存在于各種類(lèi)之間。

圖2 位點(diǎn)EBGA16的電泳效果Fig.2 Electrophoresis photograph of EBGA16注：圖中1～22分別是高原鼢鼠種群不同的個(gè)體，下同

圖3 位點(diǎn)ECT110的電泳效果Fig.3 Electrophoresis photograph of ECT110

2.3 多態(tài)信息含量、遺傳雜合度及Hardy-Weinberg 檢驗(yàn)

采用之前所篩選的9個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，開(kāi)始50個(gè)高原鼢鼠的基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度等數(shù)據(jù)在Popgene 1.32軟件和Microsatellite toolkit中進(jìn)行分析、統(tǒng)計(jì)(表1)。等位基因數(shù)在4～12，有效等位基因數(shù)平均為3.505，除EBGA26位點(diǎn)外，其余位點(diǎn)均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(表1)。

3 討論

3.1 引物通用性分析

微衛(wèi)星特性突出，被廣泛認(rèn)可，使用其作為群體遺傳學(xué)研究的標(biāo)記，效果顯著[25]，而從近緣種已有的微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選被研究物種的標(biāo)記，被認(rèn)為是一種快速而有效的方法[6]。通過(guò)對(duì)鼴鼠、甘肅鼢鼠已有的微衛(wèi)星標(biāo)記引物進(jìn)行篩選，選出鼴鼠的27對(duì)微衛(wèi)星引物，甘肅鼢鼠的60對(duì)微衛(wèi)星引物，并對(duì)87對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR成功擴(kuò)增了54對(duì)，其中鼴鼠的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增率較低，僅有17對(duì)具有穩(wěn)定的條帶，但其中有部分位點(diǎn)條帶多，不易區(qū)分，全表現(xiàn)為單態(tài)。甘肅鼢鼠中有43對(duì)擴(kuò)增成功，多態(tài)位點(diǎn)豐富。這一引物通用性情況低于其他近緣種微衛(wèi)星標(biāo)記的平均通用性，相比而言，屬于正常波動(dòng)的范圍[25]。盡管有類(lèi)似研究表明,運(yùn)用一種微衛(wèi)星引物即可擴(kuò)增同一屬、科、目下的不同物種，但此次研究中與鼴鼠的通用性較差，顯示了物種之間的差別。而在同屬的甘肅鼢鼠中通用性很好，也進(jìn)一步說(shuō)明了親緣關(guān)系對(duì)跨種應(yīng)用的影響。孫波等[26]對(duì)社鼠(Niviventerconfucianus)近緣物種大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)中已知的70個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物進(jìn)行跨種擴(kuò)增，篩選到13個(gè)適合社鼠相關(guān)研究的多態(tài)微衛(wèi)星引物。但研究未在同科的物種中檢測(cè)到通用性，這可能和物種的生物學(xué)特性有關(guān)，筆者研究的物種是地下特有的類(lèi)群，地下的生物在遺傳變異方面有別于其他物種。

表1 鼢鼠群體的遺傳多樣性指數(shù)Table 1 Genetic diversity analyses of plateau zokor

3.2 在不同種中擴(kuò)增狀況的差異

目前，微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方式很多，以通過(guò)構(gòu)建特定大小片段的基因組文庫(kù)或微衛(wèi)星富集文庫(kù)進(jìn)行篩選、從已經(jīng)公布的序列中篩查微衛(wèi)星標(biāo)記和利用近緣種之間引物的通用性得到目的物種的微衛(wèi)星標(biāo)記等[24]。一般而言，微衛(wèi)星的通用性及擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)比例隨著遺傳距離的增加呈減少的趨勢(shì)。此次試驗(yàn)中，鼴鼠和甘肅鼢鼠的微衛(wèi)星標(biāo)記在其遺傳距離較遠(yuǎn)的親緣種高原鼢鼠當(dāng)中，能夠進(jìn)行擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)及等位基因數(shù)相對(duì)較少。對(duì)于高原鼢鼠，現(xiàn)有的基因組信息不足，還沒(méi)有進(jìn)行近緣種基因組測(cè)序。此次試驗(yàn)依據(jù)鼴型鼠科的物種進(jìn)行了嘗試，但跨科擴(kuò)增的多態(tài)性很低。

如果微衛(wèi)星核心單元的重復(fù)次數(shù)發(fā)生改變，或者將DNA片段插入側(cè)翼序列中，甚至DNA片段的缺失，無(wú)論任何情況皆可使差異出現(xiàn)在不同物種間等位基因長(zhǎng)度的分布范圍當(dāng)中[25]。所出現(xiàn)的差異可用于物種的鑒定，尤其對(duì)于近緣種的DNA。研究獲得部分位點(diǎn)在高原鼢鼠中科進(jìn)行擴(kuò)增，但在甘肅鼢鼠中沒(méi)有多態(tài)，是物種特異性的標(biāo)記。此外，部分位點(diǎn)的等位基因長(zhǎng)度分布范圍差異明顯，可采用作為候選標(biāo)記，不但可以進(jìn)行分子鑒定，而且可以進(jìn)行親子鑒定，來(lái)確定這幾種鼢鼠與其雜交后代的關(guān)系。等位基因的數(shù)量可看做一種參考，來(lái)對(duì)近緣種進(jìn)行鑒定[27]。獲得的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)進(jìn)一步高原鼢鼠的研究和應(yīng)用等奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從已開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星信息的鼴形鼠科和甘肅鼢鼠物種中進(jìn)行了高原鼢鼠微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)及其通用性研究，結(jié)果表明，在87對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，只有54對(duì)進(jìn)行了成功擴(kuò)增，多態(tài)位點(diǎn)僅有9個(gè)，27個(gè)鼴形鼠科物種的微衛(wèi)星在高原鼢鼠中并沒(méi)有多態(tài)性，9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)全來(lái)自于同屬的甘肅鼢鼠?；讷@得的9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，檢測(cè)到高原鼢鼠的等位基因數(shù)在4～12，其平均觀測(cè)雜合度(Ho)0.544，期望雜合度(He) 0.671，多態(tài)信息含量0.551，研究為高原鼢鼠的微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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