啤酒糟制備低聚木糖飼料添加劑預(yù)處理?xiàng)l件研究

鄧元元，胡 超，朱文娟，陳思宇，蘭時(shí)樂

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

啤酒糟是啤酒工業(yè)中的主要副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（王金華，2002）。由于啤酒糟水分含量高，極易腐敗變質(zhì)和造成環(huán)境污染，同時(shí)，啤酒糟中還含有大量的纖維素和半纖維素，制約了啤酒糟在飼料工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)啤酒糟的研究主要集中在飼料（Belibasakis，1996）、食用菌栽培原料（葉春苗，2015；朱斌，1996）、飼用酶制劑生產(chǎn)（賓冬梅，2015；杜曉梅，2012）、魚飼料 （張健，2011）、生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料（王曉力，2016；蔡國(guó)林，2015）等領(lǐng)域。低聚木糖是一種具有獨(dú)特生理活性的功能性低聚糖，其除了具有低熱、穩(wěn)定、耐酸、安全等良好的理化特性外，還具有提高機(jī)體免疫作用（Ayyappan Appukuttan Aachary，2011）、抗腫瘤、促進(jìn)鈣吸收、降低血脂血壓以及顯著增殖雙歧桿菌和抑菌的功能（Yang，2012；韓玉潔，2006；尤新，2004；鄭建仙，2004），因此，低聚木糖已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、飼料工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等。

我國(guó)是一個(gè)啤酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，據(jù)報(bào)道，每生產(chǎn)100 L啤酒大約產(chǎn)生20 kg啤酒糟（Mussatto，2006）。目前，大部分啤酒糟被用作粗飼料直接飼喂動(dòng)物，經(jīng)濟(jì)效益低下，且啤酒糟中纖維素和半纖維素含量較高，影響動(dòng)物的消化性和適口性。本文利用碳酸鈉能使纖維素膨脹和雙氧水的氧化作用對(duì)啤酒糟進(jìn)行預(yù)處理，研究啤酒糟的預(yù)處理工藝，為進(jìn)一步生產(chǎn)富含低聚木糖的啤酒糟飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 木二糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），木三糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），木四糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%），木五標(biāo)準(zhǔn)品（純度96%），購(gòu)于青島博智匯力生物科技有限公司；碳酸鈉、雙氧水、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)，Merck公司）；高純氮（純度99%，長(zhǎng)沙高科技?xì)怏w有限公司）；纖維素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶均由湖南利爾康生物股份有限公司提供。其中纖維素酶10000 U/g，木聚糖酶100000 U/g，甘露聚糖酶8000 U/g。

1.2 主要儀器 色譜柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京英萊克科技發(fā)展有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國(guó)，WATERS）；蒸發(fā)光散色檢測(cè)器 （ELSD，美國(guó)，WATERS）；電子分析天平（KF3102，浙江凱豐集團(tuán)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（CR21G，無(wú)錫凱派克斯科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 啤酒糟干燥和粉碎 將新鮮啤酒糟置于80℃恒溫條件下烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎至60～80目。

1.3.2 啤酒糟預(yù)處理?xiàng)l件的研究 啤酒糟物理預(yù)處理方法的篩選：準(zhǔn)確稱取10.00 g啤酒糟粉于200 mL燒杯中，按固∶水＝1∶5加入超純水，攪拌均勻。分別置于110℃、微波、超聲波條件下處理30 min，酶解并干燥后，測(cè)定低聚木糖的含量?？疾觳煌锢眍A(yù)處理方法對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響。

啤酒糟化學(xué)預(yù)處理方法的篩選：準(zhǔn)確稱取10.00 g啤酒糟粉于200mL燒杯中，按固∶水＝1∶5加入超純水，攪拌均勻。分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉以及碳酸鈉（1%）+雙氧水（0.3%），110 ℃條件下處理 30 min，酶解并干燥后，測(cè)定低聚木糖的含量?？疾觳煌瘜W(xué)預(yù)處理方法對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響。

碳酸鈉和雙氧水不同添加量的篩選：分別改變碳酸鈉和雙氧水的添加量，其他條件不變，110℃條件下處理30 min，酶解并干燥后，測(cè)定低聚木糖的含量?？疾觳煌妓徕c和雙氧水添加量對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響。

固水比的篩選：分別改變啤酒糟的固水比，其他條件不變，酶解并干燥后，測(cè)定低聚木糖的含量?？疾旃趟葘?duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響。

預(yù)處理溫度的篩選：將啤酒糟分別置于90、95、100、105、110 ℃和 115 ℃條件下處理 30 min，其他條件不變，酶解并干燥后，測(cè)定低聚木糖的含量。考察不同預(yù)處理溫度對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響。

預(yù)處理時(shí)間的篩選：將啤酒糟分別預(yù)處理15、20、25、30、35min，其他條件不變，酶解并干燥后，測(cè)定低聚木糖的含量?？疾觳煌A(yù)處理時(shí)間對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響。

1.3.3 啤酒糟的酶解及低聚木糖粗提 準(zhǔn)確稱取經(jīng)過(guò)預(yù)處理并干燥后的啤酒糟粉5.00 g于100mL燒杯中，按固∶水＝1∶3加入超純水，同時(shí)按固體干重加入200U/g的木聚糖酶，攪拌均勻后，于50℃條件下酶解4 h。加入啤酒糟粉10倍質(zhì)量體積比的超純水，30℃，150 r/min條件下提取30min，然后在4000 r/min，4℃條件下離心15min，收集上清液并定容至100mL，4℃低溫保存。

1.3.4 啤酒糟預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化 根據(jù)預(yù)處理單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)低聚木糖含量影響較大的預(yù)處理因素碳酸鈉添加量、固水比、處理溫度和處理時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交優(yōu)化。正交試驗(yàn)L9（34）設(shè)計(jì)見表 1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3.5 低聚木糖含量測(cè)定 色譜柱：COSMOSIL Sugar-D 糖分析柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（69：31，V/V）；流速：0.9 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：3μL；蒸發(fā)溫度：78 ℃；載氣流速：1.6 L/min；載氣壓力：0.5MP。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒糟物理預(yù)處理方法對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響 由圖1可知，啤酒糟不同的預(yù)處理方式對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響較大。當(dāng)以110℃預(yù)處理啤酒糟后酶解產(chǎn)物中低聚木糖產(chǎn)量最大，為7.9441 mg/g，微波和超聲波預(yù)處理啤酒糟后酶解產(chǎn)物中低聚木糖產(chǎn)量差異不大。因此，選擇110℃作為預(yù)處理?xiàng)l件。

2.1.1 啤酒糟化學(xué)預(yù)處理劑對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響 試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，相同濃度下，不同的化學(xué)預(yù)處理劑對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響較大。當(dāng)以碳酸鈉和雙氧水聯(lián)合預(yù)處理啤酒糟時(shí)，酶解物中低聚木糖的產(chǎn)量最大，達(dá)8.5802mg/g。

2.1.2 碳酸鈉和雙氧水不同添加量對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響 固定碳酸鈉添加量為0.5%（m/m），分別加入不同質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)的雙氧水 （0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%），其他條件不變，測(cè)定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖3。

圖1 不同物理預(yù)處理方式對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響

圖2 化學(xué)預(yù)處理劑對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響

圖3 雙氧水添加量對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響

由圖3可知，當(dāng)雙氧水添加量為0.1%時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量最高，為10.2509mg/g。但隨著雙氧水添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量明顯下降并趨于穩(wěn)定。雙氧水作為一種強(qiáng)氧化劑，在一定濃度范圍內(nèi)能有效破壞纖維素和木質(zhì)素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，增加半纖維素的溶解能力，提高木聚糖酶對(duì)半纖維素的可及性，但濃度太高，可能抑制了雙氧水對(duì)纖維素和木質(zhì)素交聯(lián)結(jié)構(gòu)的破壞，從而降低了低聚木糖的產(chǎn)生。

選擇雙氧水添加量為0.1%，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈉 （0.3%、0.5%、0.7%、0.9和1.1%），其他條件不變，測(cè)定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖4。

圖4 碳酸鈉添加量對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著碳酸鈉添加量的增加，低聚木糖產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)碳酸鈉添加量為0.7%時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量達(dá)到13.9043 mg/g，但碳酸鈉添加量超過(guò)0.7%，低聚木糖產(chǎn)量下降。

2.1.3 固水比對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，分別調(diào)節(jié)啤酒糟的固液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 和 1∶8，其他條件不變，測(cè)定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖5。

圖5 固水比對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響

由圖5可知，隨著固液比增加，低聚木糖產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)固液比為1∶6時(shí)，低聚木糖的產(chǎn)量達(dá)14.4384 mg/g，但固液比繼續(xù)增加，低聚木糖產(chǎn)量下降。

2.1.4 預(yù)處理溫度對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響 溫度是影響纖維素和木質(zhì)素降解的主要因素之一，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，纖維素和木質(zhì)素的水解反應(yīng)和熱解反應(yīng)加快，但處理溫度過(guò)高，水解產(chǎn)物容易發(fā)生縮合反應(yīng)，從而降低半纖維素的溶出率，影響低聚木糖的產(chǎn)生。圖6結(jié)果表明，預(yù)處理溫度為110℃時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量最高，為17.1814mg/g。當(dāng)溫度超過(guò)110℃時(shí)，隨著預(yù)處理溫度的升高，低聚木糖產(chǎn)量反而下降。

圖6 預(yù)處理溫度對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的而影響

2.1.5 預(yù)處理時(shí)間對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響 在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，將啤酒糟分別處理15、20、25、30、35min，其他條件不變，測(cè)定低聚木糖的產(chǎn)量。結(jié)果見圖7。

圖7 預(yù)處理時(shí)間對(duì)低聚木糖產(chǎn)量的影響

圖7結(jié)果表明，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，低聚木糖的產(chǎn)量呈先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為30min時(shí)，低聚木糖產(chǎn)量為16.4982mg/g，但預(yù)處理時(shí)間超過(guò)30min，低聚木糖產(chǎn)量下降。原因可能是預(yù)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，啤酒糟中的半纖維素被水解為木糖、甘露糖以及阿拉伯糖等，從而降低低聚木糖的產(chǎn)量。

2.2 啤酒糟預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化 由表2可以看出，啤酒糟預(yù)處理后低聚木糖產(chǎn)量適宜的組合為A3B1C3D2，即 Na2CO30.7%，固液比為 1∶5，預(yù)處理溫度為115℃，預(yù)處理時(shí)間為30min時(shí)，低聚木糖含量為19.4693mg/g。從極差分析可知，在所選取的試驗(yàn)條件下，影響低聚木糖產(chǎn)量的主次順序?yàn)椋簻囟龋緯r(shí)間＞碳酸鈉濃度＞固水比，對(duì)低聚木糖產(chǎn)量影響最大的因素為預(yù)處理溫度，其次為預(yù)處理時(shí)間，影響最小的是固水比。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 采用碳酸鈉和雙氧水聯(lián)合對(duì)啤酒糟進(jìn)行預(yù)處理，再采用生物酶解技術(shù)將啤酒糟中的半纖維素轉(zhuǎn)化成低聚木糖，提高了啤酒糟的飼用價(jià)值和附加值。

3.2 通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)可以得出，利用啤酒糟生產(chǎn)富含低聚木糖飼料添加劑預(yù)處理適宜條件為碳酸鈉添加量0.7%，雙氧水添加量0.1%，固液比1∶5，預(yù)處理溫度115℃，預(yù)處理時(shí)間30min。在此條件下，低聚木糖產(chǎn)量為19.4693mg/g。

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