慢性丙型肝炎外周血miR-1273g-3p水平變化及其診斷肝纖維化分期的效能分析*

王婧婧，張瑜，董娜，韓振坤，翟景明

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)肝纖維化的研究重點逐漸轉(zhuǎn)移至與纖維化發(fā)生相關(guān)的基因研究上，如MicroRNA（miRNA）是一種非編碼單鏈RNA，長約22 nt[1-5]。在靜息狀態(tài)下，人類HSC與激活后的HSC存在miRNAs水平差異[6]。本研究檢測了慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）患者外周血miR-1273g-3p水平變化，并分析了其與肝纖維化分期的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年2月～2017年2月我科收治的CHC患者57例，男35例，女22例；年齡20～52歲，平均年齡（36.1±7.8）歲。符合《慢性丙型肝炎防治指南》的診斷標準，排除甲型、乙型、戊型肝炎病毒和HIV混合感染者，排除酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病，排除合并嚴重的內(nèi)分泌系統(tǒng)、腦血管系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤、預(yù)計生存期短于4個月患者。另選擇同期在我院健康體檢者21例作為對照，男性15例，女性6例；平均年齡（35.2±5.6）歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有受試者簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 肝穿刺活檢術(shù) 囑患者取平臥位或左側(cè)臥位，在B超引導(dǎo)下選擇穿刺點和進針途徑，先后取出肝組織2～3條，置入10%甲醛溶液中固定、送檢。在肝組織病理學(xué)檢查時，采用Metavir評分判斷肝纖維化程度，F(xiàn)0：無纖維化；F1：局限性匯管區(qū)纖維增生，竇周和小葉內(nèi)纖維化；F2：纖維化擴大至匯管區(qū)周圍，伴纖維間隔形成，肝小葉結(jié)構(gòu)保留；F3：纖維間隔形成伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；F4：早期肝硬化。

1.3 治療方法 給予患者長效干擾素-α2b聯(lián)合利巴韋林標準療法治療12 m。

1.4 臨床檢測 抽取空腹外周靜脈血5 ml，常規(guī)檢測血生化、抗-HCV和HCV RNA。

1.5 血清miR-1273g-3p水平測定 采集所有待檢人員外周靜脈血3 ml，分離血漿，在4℃下12000 r/m離心12 min，吸取血清250μl，加入1.5 ml Eppendorf離心管，加入相關(guān)內(nèi)參對照和試劑，在漩渦器上充分混勻，放置5 min，使用改良的miRNA提取方法提取miRNA，并測定其純度和濃度。測定完畢后，行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測，本研究所用引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Spearman秩相關(guān)分析miR-1273g-3p水平與肝纖維化分期的相關(guān)性。繪制受試者工作特征曲線（ROC）并計算miR-1273g-3p曲線下面積，評價其診斷肝纖維化分期的效能。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 CHC患者與健康人血清miR-1273g-3p水平比較 與健康人比，存在肝纖維化的CHC患者血清miR-1273g-3p水平顯著升高，而顯著肝纖維化患者血清miR-1273g-3p相對水平顯著高于輕度肝纖維化患者（P＜0.05，表2）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHC患者血清miR-1273g-3p水平與肝纖維化分期呈正相關(guān)（r=0.657,P＜0.001）。

2.2 CHC患者血清miR-1273g-3p相對水平變化 在抗病毒治療12 m末，CHC F0期、F1-2期和F3-4期患者血清miR-1273g-3p相對水平依次變化為（1.03±0.4）、（1.43±0.22）和（3.97±0.2），均顯著低于治療前（P＜0.05）。

表2 CHC患者與健康人血清miR-1273g-3p水平（±s）比較

表2 CHC患者與健康人血清miR-1273g-3p水平（±s）比較

與健康人或CHC F0期比，①P＜0.05；與F1-2期比，②P＜0.05

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2.3 血清miR-1273g-3p水平診斷肝纖維化分期的效能分析 在治療前，分別以血清miR-1273g-3p水平＞1.68和血清miR-1273g-3p水平＞4.20為截斷點診斷存在肝纖維化和顯著肝纖維化，其ROC曲線下面積（AUC）分別為 0.830，95%CI為0.714～0.973，診斷的靈敏度為72.2%，特異度為86.4%，和0.864，95%CI為 0.701～0.976，診斷的靈敏度為83.6%，特異度為78.4%（圖1）；在治療后，經(jīng)肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)CHC患者F0期、F1期、F2期、F3、F4期依次為 15例、9例、14例、11例、8例。血清miR-1273g-3p水平診斷存在肝纖維化和顯著肝纖維化的AUC分別為0.814，95%CI為0.768～0.945，診斷的靈敏度為71.4%，特異度為82.7%，和為0.853，95%CI為0.841～0.959，診斷的靈敏度為80.3%，特異度為84.2%（圖2）。

圖1 血清miR-1273g-3p診斷肝纖維化的效能分析（治療前）

圖2 血清miR-1273g-3p診斷肝纖維化的效能分析（治療后）

3 討論

人類miRNA家族包含1424種前體編碼的1733種成熟miRNA。雖然miRNA序列數(shù)量僅占人類基因序列的1%～3%，但參與近1/3基因水平的調(diào)控，在機體生長發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[8，9]。近年來，眾多研究[10，11]發(fā)現(xiàn)miRNA在肝臟分化、形態(tài)維持和功能維護中發(fā)揮重要的作用。另有最新研究顯示[12]，miRNA分子不僅存在于細胞中，還可出現(xiàn)在循環(huán)中。miRNA對RNA酶的降解反應(yīng)穩(wěn)定，可作為活躍的生物學(xué)標志物，但不同疾病血清miRNA分子水平不同，不同組織的miRNA分子具有組織特異性，故通過研究血清/血漿miRNA分子水平以評估患者病情發(fā)展將成為可能。

CHC的發(fā)生主要通過輸血、靜脈注射、生活密切接觸等方式傳播，感染率約為3%，其中CHC約占感染總數(shù)的70%～85%[13]。隨著肝炎的進展，部分CHC可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，因早期肝纖維化是可逆的，故臨床強調(diào)早期診斷病情并予以積極治療可促進患者康復(fù)，避免肝硬化和肝癌發(fā)生[14，15]。肝組織病理學(xué)活檢是診斷肝纖維化的金標準，但屬于有創(chuàng)檢查，且肝組織纖維化分布不均，無法全面地評估病情發(fā)展，導(dǎo)致肝組織活檢存在一定的局限性[16]。

隨著分子生物學(xué)研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)多種慢性肝臟疾病均伴miRNA的水平差異，如藥物性肝損傷、病毒性肝炎、酒精性肝病等，miRNA調(diào)控的靶基因，包括轉(zhuǎn)化生長因子β1、血小板衍生生長因子、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等多種細胞因子均可表現(xiàn)為不同[17]。轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad可以抑制正常肝細胞的增殖，激發(fā)肝星狀細胞（HSC）激活，促進ECM的生成與沉積。另一反面，轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad信號通路可導(dǎo)致細胞基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子上調(diào)，從而導(dǎo)致ECM降解降低。在組織纖維化過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad信號通路的激活又可促進一些纖維化因子的活化，如血管內(nèi)皮生長因子和整合素等。因此，miRNA在轉(zhuǎn)化通路中發(fā)揮重要的作用[18-20]。CHC患者血清轉(zhuǎn)氨酶水平與干擾素應(yīng)答基因呈正相關(guān)[21]，通過對比活化型HSCs與靜息型HSCs miRNA水平，發(fā)現(xiàn)HSCs活化過程中明顯上調(diào)的基因包括 miR-125b、miR-132 和 miR-1273 等[22]，并有學(xué)者采用雙熒光素酶報告基因檢測驗證了miR-1273g-3p與PTEN特異性結(jié)合，提出miR-1273g-3p可能通過調(diào)控PTEN來參與肝纖維化的進展[23]?；谏鲜鲅芯?，本課題組檢測了不同肝纖維化程度的CHC患者血清miR-1273g-3p水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康人與F0期CHC患者血清miR-1273g-3p相對水平無顯著性差異，但存在肝纖維化的F1-2期組和F3-4期組血清miR-1273g-3p相對水平顯著升高，且F3-4期組水平最高，顯示出隨著肝纖維化的發(fā)展，血清miR-1273g-3p水平逐漸上升。經(jīng)繪制ROC曲線分析，并計算ROC曲線下面積，結(jié)果顯示血清miR-1273g-3p相對水平具有一定的診斷肝纖維化的效能，無論在治療前還是經(jīng)抗病毒治療后的CHC患者，血清miR-1273g-3p相對水平均與肝纖維化程度呈正相關(guān)。在治療前，分別以血清miR-1273g-3p水平＞1.68和血清miR-1273g-3p水平＞4.20為截斷點診斷存在肝纖維化和顯著肝纖維化，其ROC曲線下面積（AUC）分別為0.830，95%CI為0.714～0.973，診斷的靈敏度為72.2%，特異度為86.4%，和 0.864，95%CI為 0.701～0.976，診斷的靈敏度為83.6%，特異度為78.4%。在治療后，其結(jié)果也類似。由此可見，臨床醫(yī)師可把循環(huán)血miR-1273g-3p水平作為診斷肝纖維化分期的參考指標之一。

總之，循環(huán)血miR-1273g-3p水平可有效反映肝功能損害和肝纖維化程度，監(jiān)測其血清水平將有助于對肝纖維化的診斷及分期判斷。但鑒于本研究樣本小，檢測方法還不穩(wěn)定，可能在一定程度上影響了本研究結(jié)論的可靠性。在以后的研究中，還需要擴大樣本量，并與其他疾病檢測結(jié)果相比較，以充分論證血清miR-1273g-3p水平對肝纖維化的診斷價值。

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