選擇性β3腎上腺素能受體激動劑對非酒精性脂肪性肝病大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)和肝組織纖維化的影響

王新偉，呂柯，孫曉，張菊

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是臨床較為常見的慢性肝病，以肝細(xì)胞彌漫性大泡性脂肪變性和脂肪儲積為主要特征的臨床綜合征，可進展為脂肪性肝纖維化、肝硬化以及終末期肝衰竭[1]。目前，NAFLD發(fā)病機制尚不明確。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，β3腎上腺素能受體（β3-adrenergic receptor，β3-AR）能與其特異性配體結(jié)合，參與機體脂質(zhì)代謝和體質(zhì)量控制等多種生理效應(yīng)。β3-AR功能障礙可能導(dǎo)致多種生理效應(yīng)的異常，如脂質(zhì)代謝異常、肥胖、胰島素抵抗等[2-4]，可能參與了NAFLD的發(fā)病過程。本研究采用高脂飲食建立大鼠NAFLD模型，觀察了β3-AR激動劑干預(yù)對動物血脂、肝功能、氧化應(yīng)激和肝纖維化指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 無特定病原體（sprcific pathogen free，SPF）級健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，飼養(yǎng)溫度（22±3）℃，濕度為60%～80%。高脂飼料（42%脂肪+17%蛋白質(zhì)+41%碳水化合物）購自上海斯萊克實驗動物研究有限公司；普通飼料（14%脂肪+24%蛋白質(zhì)+62%碳水化合物）由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；β3-AR激動劑（BRL 37344）購自美國Sigma公司；檢測大鼠透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，檢測轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的ELISA試劑盒購自美國R＆D公司；檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase-Px，GSH-Px）試劑盒購自南京建成生物科技研究所；AU5800全自動生化分析儀為美國貝克曼公司產(chǎn)品。

1.2 動物NAFLD模型的建立 將30只大鼠隨機分為對照組（NC）組、高脂模型組（HC組）和β3-AR激動劑干預(yù)組（BRL組），每組10只。在NC組，給予普通飼料喂養(yǎng)14 w，第8 w末時，給予0.9%氯化鈉溶液4 nmol·kg-1尾靜脈注射；在HC組，給予高脂飼料喂養(yǎng)14 w，第8 w末時給予0.9%氯化鈉溶液4 nmol·kg-1尾靜脈注射；在BRL組，給予高脂飼料喂養(yǎng)14 w，第8 w末時給予BRL-37344 4 nmol·kg-1尾靜脈注射。3組均2次/w注射，持續(xù)用藥6 w。在14 w末，大鼠隔夜禁食12 h，3%戊巴比妥鈉麻醉，采用斷頭法處死所有動物，迅速按常規(guī)采血8～10 mL，3000 r/m離心10 min，分離上層血清，并轉(zhuǎn)移入新的EP管中，-80℃低溫下保存。采血后，迅速摘除肝臟稱質(zhì)量，-80℃低溫下保存。將低溫保存的肝組織于4℃冰箱解凍，測定。

1.3 檢測方法 取血清，室溫解凍，使用全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯（triglycerid，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）；采用 ELISA 法檢測血清HA和TGF-β1）。精確稱取肝組織200 mg，勻漿，冰浴條件下2000 r/m離心3～5 min，制備10%肝組織勻漿。使用分光光度計測定肝組織勻漿SOD、MAD 和 GSH-Px。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查 將固定后的肝組織進行石蠟包埋、切片，分別行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，在光鏡下觀察非酒精性脂肪性肝病活動積分（NAFLD activity，NAS）和肝纖維化分期。NAS評分包括肝細(xì)胞脂肪變性（＜5%為0分，5%～33%為1分，34%～66%為2分，＞66%為3分）、炎性浸潤（20倍光鏡下計算壞死病灶，無為0分，＜2個為1分，2～4個為2分，＞4個為3分）和氣球樣變（無為0分，少見為1分，多見為2分）；肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)：無為0分，少量門脈區(qū)纖維化，有或無細(xì)胞間隔纖維化為1分，大量門脈區(qū)纖維化，有或無細(xì)胞間隔纖維化為2分，大量門脈區(qū)纖維化伴隨少量的不典型橋接纖維化為3分，大量的門脈區(qū)纖維化伴有顯著的橋接纖維化為4分，顯著的橋接纖維化，有或無不典型的假小葉為5分，高度可疑或診斷為肝硬化為6分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，分析前先檢驗數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LDS-t檢驗；對非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)比較 HC組和BRL 組血清 TC、TG、ALT、AST、HA 和 TGF-β1 顯著高于對照組（P＜0.05），而BRL組上述指標(biāo)顯著高于 HC 組（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠血生物化學(xué)指標(biāo)（±s）比較

表1 各組大鼠血生物化學(xué)指標(biāo)（±s）比較

與NC組比，①P＜0.05；與HC組比，②P＜0.05

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2.2 三組大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px水平比較 HC組和BRL組肝組織SOD和GSH-Px水平顯著低于，而MDA水平顯著高于HC組（P＜0.05）；BRL組肝組織SOD和GSH-Px水平顯著低于，而MDA水平顯著高于HC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 三組大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px 水平（±s）比較

表2 三組大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px 水平（±s）比較

與NC組比，①P＜0.05；與HC組比，②P＜0.05

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2.3 三組大鼠肝組織病理學(xué)變化情況的比較 HC組和BRL組肝組織脂肪變性、炎性浸潤、氣球樣變和纖維化評分均顯著高于NC組（P＜0.05），而BRL組上述指標(biāo)顯著高于HC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3、圖 1、圖 2）。

表3 三組大鼠肝組織病理學(xué)評分（±s）比較

表3 三組大鼠肝組織病理學(xué)評分（±s）比較

與NC組比，①P＜0.05；與HC組比，②P＜0.05

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圖1 肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，100×）

圖2 肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（Masson，100×）

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展的共同途徑，以細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白沉積為特征，伴隨肝臟功能和結(jié)構(gòu)的異常，繼續(xù)發(fā)展可誘發(fā)肝硬化或肝癌[5，6]。

目前，NAFLD發(fā)病機制尚不明確，以“二次打擊”學(xué)說占主導(dǎo)地位，即胰島素抵抗、氧化應(yīng)激反應(yīng)和異常的細(xì)胞因子參與的炎癥反應(yīng)為核心的二次打擊導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥壞死、肝纖維化[9，10]。在NAFLD發(fā)生后，肝細(xì)胞內(nèi)過剩的游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷。既往研究報道，肝細(xì)胞損傷時ROS含量明顯升高[11]。ROS含量增多可導(dǎo)致機體內(nèi)多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并形成脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，LPO），LPO可通過炎性細(xì)胞浸潤激活肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSCs），引發(fā)肝纖維化，啟動TGF-β1、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，加重機體炎性反應(yīng)，增加纖維細(xì)胞生成。有研究報道，TGF-β1可促使HSCs活化，是肝纖維化的始動因子[12，13]。SOD和GSH-Px可清除機體內(nèi)多余的氧自由基，而MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的典型代表，其水平可代表機體細(xì)胞受氧自由基攻擊的程度[14]。

β3-AR為一種G蛋白偶聯(lián)的膜表面受體，具有調(diào)節(jié)脂肪分解和消耗的作用。近年來，有研究表明，β3-AR與胰島素抵抗和肥胖密切相關(guān)[15，16]，還有研究指出，β3-AR異?？赡軐?dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[17-19]。國內(nèi)研究報道，兒茶酚胺可通過β3-AR與鳥嘌呤核苷酸和腺苷酸環(huán)化酶等作用，刺激細(xì)胞脂肪氧化分解，抑制肝臟脂肪合成，控制NAFLD進展[19，20]。因此，考慮β3-AR可能參與了NAFLD發(fā)生過程。鑒于此，我們觀察了β3-AR受體激動劑對NAFLD大鼠肝臟氧化應(yīng)激及血清肝纖維化指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HC組在BRL-373干預(yù)后，氧化應(yīng)激反應(yīng)及肝纖維化程度加劇，提示AR-β3激動劑可能加重NAFLD肝纖維化形成。

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