牛奶中β-內(nèi)酰胺高靈敏度檢測(cè)試劑條研制（膠體金法）

□ 宋文 丹東市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

□ 何魯江 杭州諾威泰克生物技術(shù)有限公司

目前，快速檢測(cè)試劑條一般采用抗原抗體反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)目標(biāo)檢測(cè)物。但是由于牛奶樣本中蛋白質(zhì)含量較高，容易干擾檢測(cè)結(jié)果，且對(duì)于靈敏度要求高，普通的抗體無(wú)法達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)靈敏度的要求。膠體金法采用受體結(jié)合的原理來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物，由于受體結(jié)合的親和力是抗原抗體結(jié)合親和力的兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上，因此在牛奶中使用受體結(jié)合的原理來(lái)制備β-內(nèi)酰胺高靈敏度檢測(cè)試劑條成為一個(gè)有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陽(yáng)性奶樣、陰性奶樣、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化學(xué)試劑（采購(gòu)自Sigma）。鎳柱（GE life）、PET-30a質(zhì)粒（通用生物）、β-內(nèi)酰胺BSA偶聯(lián)物（購(gòu)自杭州隆基生物）。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（湘儀）、搖床（湘儀）、蛋白分離柱（Bio-Rad）、分光光度計(jì)（新世紀(jì)）。

1.3 方法

1.3.1 重組β-內(nèi)酰胺受體制備

查閱NCBI上β-內(nèi)酰胺的序列，篩選出適合大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的序列如下：

ACAGGCACTCGCTTTGGAACAGATTTAGCGAAGGAAGCTA AGAAGGTTCATCAAACCACCCGTACAGTTCCTGCCAAACGTGGG ACTATTTATGACCGAAATGGAGTCCCGATTGCTGAGGATGCAAC CTCCTATAATGTCTATGCGGTCATTGATGAGAACTATAAGTCAGC AACGGGTAAGATTCTTTACGTAGAAAAAACACAATTTAACAAGG TTGCAGAGGTCTTTCATAAGTATCTGGACATGGAAGAATCCTAT GTAAGAGAGCAACTCTCGCAACCTAATCTCAAGCAAGTTTCCTT TGGAGCAAAGGGAAATGGGATTACCTATGCCAATATGATGTCTA TCAAAAAAGAATTGGAAGCTGCAGAGGTCAAGGGGATTGATTT TACAACCAGTCCCAATCGTAGTTACCCAAACGGACAATTTGCTT CTAGTTTTATCGGCCTAGCTCAGCTCCATGAAAATGAAGATGGA AGCAAGAGCTTGCTGGGAACCTCTGGAATGGAGAGTTCCTTGA ACAGTATTCTTGCAGGGACAGACGGCATTATTACCTATGAAAAG GATCGTCTGGGTAATATTGTACCCGGAACAGAACAAGTTTCCCA ACGAACGATGGACGGTAAGGATGTTTATACAACCATTTCCAGCC CCCTCCAGTCCTTTATGGAAACCCAGATGGATGCTTTTCAAGAG AAGGTAAAAGGAAAGTACATGACAGCGACTTTGGTCAGTGCTAA AACAGGGGAAATTCTGGCAACAACGCAACGACCGACCTTTGAT GCAGATACAAAAGAAGGCATTACAGAGGACTTTGTTTGGCGTG ATATCCTTTACCAAAGTAACTATGAGCCAGGTTCCACTATGAAA GTGATGATGTTGGCTGCTGCTATTGATAATAATACCTTTCCAGG AGGAGAAGTCTTTAATAGTAGTGAGTTAAAAATTGCAGATGCCA CGATTCGAGATTGGGACGTTAATGAAGGATTGACTGGTGGCAG AATGATGACTTTTTCTCAAGGTTTTGCACACTCAAGTAACGTTG GGATGACCCTCCTTGAGCAAAAGATGGGAGATGCTACCTGGCT TGATTATCTTAATCGTTTTAAATTTGGTGTTCCGACCCGTTTCG GTTTGACGGATGAGTATGCTGGTCAGCTTCCTGCGGATAATATT GTCAACATTGCGCAAAGCTCATTTGGACAAGGGATTTCAGTGA CCCAGACGCAAATGATTCGTGCCTTTACAGCTATTGCTAATGAC GGTGTCATGCTGGAGCCTAAATTTATTAGTGCCATTTATGATCC AAATGATCAAACTGCTCGGAAATCTCAAAAAGAAATTGTGGGAA ATCCTGTTTCTAAAGATGCAGCTAGTCTAACTCGGACTAACATG GTTTTGGTAGGGACGGATCCGGTTTATGGAACCATGTATAACCA CAGCACAGGCAAGCCAACTGTAACTGTTCCTGGGCAAAATGTA GCCCTCAAGTCTGGTACGGCTCAGATTGCTGACGAGAAAAATG GTGGTTATCTAGTCGGGTTAACCGACTATATTTTCTCGGCTGTA TCGATGAGTCCGGCTGAAAATCCTGATTTTATCTTGTATGTGAC GGTCCAACAACCTGAACATTATTCAGGTATTCAGTTGGGAGAAT TTGCCAATCCTATCTTGGAGCGGGCTTCAGCTATGAAAGACTCT CTCAATCTTCAAACAACAGCTAAAGCTTTGGAGCAAGTAAGTCA ACAAAGTCCTTATCCTATGCCTAGTGTCAAGGATATTTCACCTG GTGATTTAGCAGAAGAATTGCGTCGCAATCTTGTACAACCCATC GTTGTGGGAACAGGAACGAAGATTAAAAACAGTTCTGCTGAAG AAGGGAAGAATCTTGCCCCGAATCAGCAAGTCCTTATCTTATCT GATAAAGCAGAGGAGGTTCCAGATATGTATGGTTGGACAAAGG AGACTGCTGAGACCCTTGCTAAGTGGCTCAATATAGAACTTGAA TTTCAAGGCTCGGGCTCTACTGTGCAGAAGCAAGATGTTCGTG CTAACACAGCTATCAAGGACATTAAAAAAATTACATTAACTTTAG GAGAC。序列長(zhǎng)度為1677bp，經(jīng)第三方序列合成公司（通用生物）合成，測(cè)序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)突變。

1.3.1.1 單克隆陽(yáng)性菌體制備

①將合成的質(zhì)粒凍干粉使用100μL滅菌超純水稀釋。

②吸取稀釋后的質(zhì)粒溶液10μL，加入到100μL的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min。

③完成冰浴后，42℃金屬浴熱擊90s后冰浴2min。

④將制備好的感受態(tài)細(xì)胞接種于1mL LB液體培養(yǎng)基（加入終濃度萬(wàn)分之一的卡納抗生素），37℃ 、250rpm培養(yǎng)1h。

⑤培養(yǎng)后的菌體吸取200μL，涂LB固體培養(yǎng)基平板（卡納抗性），37℃烘箱靜止過(guò)夜。

⑥挑取菌落生長(zhǎng)旺盛，邊緣清晰的單菌落，接種于1mL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 、250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3.1.2 陽(yáng)性單克隆蛋白表達(dá)鑒定

①吸取單克隆菌10μL,加入到10mL LB液體培養(yǎng)基中（2管），37℃、250rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

②將10mL培養(yǎng)好的菌體加入到250mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃ 、250rpm）,每1h測(cè)試菌體濃度，當(dāng)菌體吸光度超過(guò)0.6之后，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（4h），其中一管為對(duì)照管不進(jìn)行誘導(dǎo)。

③將兩瓶菌液分別離心10分鐘，轉(zhuǎn)速為8000rpm，溫度設(shè)為4℃。然后棄去上清，將沉淀使用PBS稀釋攪拌30min。將稀釋后的菌體放入到細(xì)胞粉碎儀中粉碎15min。在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心30min，溫度控制為4℃，保留上清。

④離心后的沉淀物使用inding Buffer A(50mM Tris，8M Urea，0.5M NaCl，pH8.0）室溫溶解10min后，12000rpm，4℃離心30min，取上清。

⑤將收集到的兩份上清進(jìn)行蛋白電泳。

圖1 電泳圖譜

經(jīng)蛋白電泳鑒定，β-內(nèi)酰胺受體蛋白主要為包涵體表達(dá)，上清表達(dá)量較低。

1.3.2 試紙的制作

1.3.2.1 重組β-內(nèi)酰胺受體標(biāo)記膠體金

①500mL超純水加熱至沸騰，加入終濃度為1.5/10000的氯金酸后再加入2.25/10000的檸檬酸三鈉。攪拌反應(yīng)10min后，水浴冷卻。

②100mL制備好的膠體金溶液使用0.2M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)PH到9.0，加入重組的β-內(nèi)酰胺受體蛋白，室溫?cái)嚢?0min。

③加入1mL 10%的BSA水溶液，封閉30min。

④以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min，棄去上清，沉淀使用金標(biāo)保存液稀釋（Tris：0.25%、BSA：1%）回收冷藏保存。

⑤將標(biāo)記好的金標(biāo)溶液，使用金標(biāo)稀釋液稀釋到OD540吸光度為OD5(溶液中加入終濃度為2%的蔗糖和1%的海藻糖)，每個(gè)酶標(biāo)孔加入稀釋的金標(biāo)溶液10μL,放置于45℃烘箱過(guò)夜干燥。

1.3.2.2 β-內(nèi)酰胺BSA偶聯(lián)物包被

①將β-內(nèi)酰胺BSA偶聯(lián)物使用PBS稀釋到0.2mg/mL（終濃度1%蔗糖）。

②使用劃膜儀將稀釋好的β-內(nèi)酰胺BSA偶聯(lián)物包被到NC膜上，45℃烘箱過(guò)夜干燥

1.3.2.3 試紙條組裝

將包被好的底板與吸水濾紙、濾膜按照正常程序組裝黏貼。

1.3.3 試紙條檢測(cè)

將青霉素使用陰性奶樣稀釋，建立梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度值分別為0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。該試紙條采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理，陽(yáng)性為一條線，陰性為兩條線。分別吸取不同濃度值的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品各100μL，使用移液器反復(fù)抽打10次后將組裝好的試紙條插入到酶標(biāo)孔中10秒鐘，5min后觀察并記錄相應(yīng)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1）表明，該方法建立的牛奶中β-內(nèi)酰胺快速檢測(cè)試紙條的靈敏度為0.5ppb，當(dāng)檢測(cè)樣本中的β-內(nèi)酰胺濃度超過(guò)0.5ppb將被檢出陽(yáng)性。

表1 濃度質(zhì)控平均原始值