HPA及NRF2與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性研究

邱新峰，程萬民

(天津市第五中心醫(yī)院耳鼻喉科 300450)

喉鱗狀細(xì)胞癌是較為常見的口腔上皮惡性腫瘤，臨床預(yù)后較差。流行病學(xué)研究顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率為0.5%～1.7%，在部分地區(qū)的發(fā)病率更高，可上升3～4倍[1]。近年來基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究顯示，生物學(xué)因子的改變可影響喉鱗狀細(xì)胞的增殖、癌細(xì)胞的侵襲或轉(zhuǎn)移等病理過程，促進(jìn)早期上皮性惡性腫瘤的進(jìn)展[2-3]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供條件，而核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2 associated factor ，NRF2)能夠影響到氧化應(yīng)激損傷或者氧自由基的傳遞，促進(jìn)早期鱗狀細(xì)胞的病變[4]。為了進(jìn)一步揭示HPA及NRF2與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，本研究收集2015年2月至2017年2月本院保存的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本81份，觀察二者的異常表達(dá)，研究其與患者臨床病理特征間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月至2017年2月本院保存的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本81份(病例組)，標(biāo)本來源患者中男52例，女29例,平均年齡(51.42±8.92)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者臨床病理資料保存完整；(2)經(jīng)病理確診為喉鱗狀細(xì)胞癌；(3)術(shù)前未接受過放化療等治療；(4)患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床病理資料不完整；(2)合并其他原發(fā)性腫瘤。同時(shí)選取聲帶息肉病理標(biāo)本77份(對(duì)照組)，標(biāo)本來源患者中男42例，女35例，平均年齡(50.89±9.10)歲。兩組受試者年齡、性別比較差異無統(tǒng)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法 采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室溫孵育5 min，采用去離子水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 mL純水)封閉，室溫孵育5 min，加入HPA抗體(鼠來源，購自南京碧云天生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標(biāo)記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測(cè)公司)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，然后加入硝基四氮唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(NBT/BCIP)色劑顯色5 min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.2.2Western blot檢測(cè) 冰上分離出組織，置于預(yù)冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。冰上靜置60 min，室溫下20 000 r/min離心60 min，取出下層沉淀。按總蛋白80 g計(jì)算上樣容積，按照比例為3∶1或者4∶1的比例上TBS緩沖液，加入20 μL緩沖液后于45 V電壓下進(jìn)行電泳操作，脫脂蛋白封閉2 h，加入NRF2抗體(鼠來源，購自南京碧云天生物科技有限公司)各10 μL后室溫下孵育2 h，2 h后加入二抗(兔來源，購自南京凱基生物科技有限公司)。采用日本Panasoic公司生存的HSO-900系統(tǒng)影像分析儀器進(jìn)行圖像分析。

1.2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 HPA陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色染色。每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野，將陽性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)，分別對(duì)應(yīng)0、1、2、3分。其中陽性細(xì)胞比例小于25%為0分，≥25%～<50%為1分，≥50%～<75%為2分，≥75%為3分；無染色為0分，淺黃色為1分，橘黃色為2分，棕黃色為3分。將陽性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度得分相加后除2得出最終分?jǐn)?shù)，其中得分小于1.5分為陰性，≥1.5分為陽性。

2 結(jié) 果

2.1兩組HPA及NRF2表達(dá)比較 病例組和對(duì)照組的HPA陽性表達(dá)率和NRF表達(dá)量分別為81.48%、19.48%和0.844±0.113、0.202±0.094，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

圖1 Western blot檢測(cè)圖

A:病例組(SP,×400)；B：對(duì)照組(SP,×200)

圖2兩組HPA陽性表達(dá)免疫組織化學(xué)圖

2.2患者HPA陽性表達(dá)與病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別和病灶部位患者HPA陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，不同的病理分化、TNM分期患者HPA陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 患者HPA陽性表達(dá)與病理特征的關(guān)系

續(xù)表1 患者HPA陽性表達(dá)與病理特征的關(guān)系

2.3患者NRF2表達(dá)與病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別和病灶部位患者NRF2表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，不同的病理分化、TNM分期患者NRF2水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 患者NRF2水平與病理特征的關(guān)系

3 討 論

喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生主要考慮與遺傳、吸煙或者放射性因素等有關(guān)，特別是在吸煙人群中，喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率高于55%[5]。喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床預(yù)后較差，5年生存率小于36%，中位生存時(shí)間不足36個(gè)月[6-7]。一項(xiàng)樣本量為334例，且臨床分期為中晚期的喉鱗狀細(xì)胞癌治療隨訪研究顯示，疾病的治療總體有效率小于30%，治療后的復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高[8-9]，病死率持續(xù)性維持在較高的水平[10]。對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過程中相關(guān)生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究，不僅可以為喉鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)靶向治療提供參考，還可以為喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床預(yù)后隨訪提供可靠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

HPA的結(jié)構(gòu)上包含了3～4個(gè)糖蛋白配體結(jié)構(gòu)，能夠在結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)促進(jìn)其分解，通過分解細(xì)胞外膠原纖維Ⅳ或者膠原纖維Ⅴ等，降低細(xì)胞間的緊密連接程度，為癌細(xì)胞的早期增殖或者轉(zhuǎn)移提供空間；NRF2能夠在細(xì)胞水平影響到氧化應(yīng)激代謝，促使氧自由基傳遞異常導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷，以及喉鱗狀上皮早期增殖調(diào)控異常，影響到癌細(xì)胞的持續(xù)性病變的發(fā)生[11-12]。已有的研究探討了NRF2及HPA等在喉癌患者中的異常表達(dá)，但缺乏對(duì)于其與患者臨床病理特征間的關(guān)系研究，此為本次研究的創(chuàng)新點(diǎn)。

本次研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組患者的病灶組織中HPA及NRF2表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組織，提示HPA及NRF2二者可能參與到了喉鱗狀細(xì)胞癌的早期發(fā)生過程，HPA及NRF2的高表達(dá)可以從下列兩個(gè)方面影響到喉癌的進(jìn)展：(1)HPA的高表達(dá)能夠提高癌細(xì)胞的早期變形及突破基底膜的能力，促使其早期臨床分期的進(jìn)展；(2)NRF2的高表達(dá)能夠使三磷酸腺苷(ATP)能量代謝利用障礙，促進(jìn)線粒體氧化應(yīng)激異常，導(dǎo)致喉鱗狀細(xì)胞的細(xì)胞增殖調(diào)控紊亂。有研究者在探討喉癌患者的發(fā)病機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，HPA及NRF2在喉癌患者血清及病灶組織中均存在一定程度的異常表達(dá)，且相關(guān)表達(dá)水平越高，患者病情越重、臨床遠(yuǎn)期預(yù)后越差[13-14]。在探討不同的臨床特征與生物學(xué)因子的關(guān)系過程中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者HPA陽性表達(dá)率更高，提示HPA可顯著影響到淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等病理過程。從機(jī)制上考慮HPA對(duì)于相關(guān)臨床病理特征的影響主要為：(1)HPA促進(jìn)了癌細(xì)胞對(duì)于淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，提高了其通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；(2)HPA能夠影響到癌組織對(duì)于臨床正常口腔組織或者器官的浸潤(rùn)，促進(jìn)臨床分期的進(jìn)展。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)HPA可以顯著影響到癌細(xì)胞的分化程度，加劇癌細(xì)胞分化不良或者低分化的風(fēng)險(xiǎn)。在探討NRF2與喉癌患者臨床特征的關(guān)系過程中，本研究也發(fā)現(xiàn)NRF2與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等特征具有明顯的關(guān)系，這些均提示了NRF2等與喉癌病情有密切聯(lián)系。HPA及NRF2可能在下列兩個(gè)方面發(fā)揮了一定的協(xié)同作用，從而促進(jìn)了喉癌特別是鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生：(1)HPA及NRF2的高表達(dá)均可能影響乙?；鶊F(tuán)的修飾及羧基末端的空間結(jié)構(gòu)，干預(yù)喉癌上皮細(xì)胞的增殖、分化；(2)HPA及NRF2的協(xié)同表達(dá)可能影響核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，增加癌細(xì)胞DNA異常增殖的風(fēng)險(xiǎn)。但更為具體的內(nèi)在機(jī)制的探討，仍然需要后續(xù)基礎(chǔ)研究證實(shí)。

綜上所述，喉鱗狀細(xì)胞癌患者HPA及NRF2表達(dá)明顯升高，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及病理分級(jí)有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。但本研究對(duì)于相關(guān)生物學(xué)因子的多元線性回歸的研究不足，存在一定的局限。

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