蒲公英甾醇對氧化損傷心肌細(xì)胞保護作用研究*

王娓娓，張紅苗，王 琳，鮑天昊，3△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科三病區(qū)，昆明 650101；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽科，昆明 650101；3.云南省精神病醫(yī)院老年科，昆明 650224)

缺血的心肌發(fā)生再灌注后，心肌的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷不能立即恢復(fù)反而加重的現(xiàn)象稱心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIR)[1]。心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是MIR血運重建后的主要病理生理特征，因此保護損傷的心肌細(xì)胞，使其增加抵抗氧化損傷的能力對MIR治療有著重要的意義[2]。然而，目前卻缺少有效防止MIR所致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的方法。蒲公英甾醇為蒲公英根中三萜類活性成分，已有報道蒲公英甾醇具有抗腫瘤，抗炎，抗氧化等多種藥理學(xué)作用[3]，但對MIR的保護作用未完全清楚。本文就蒲公英甾醇對MIR發(fā)揮保護作用的部分機制進行研究，以期為心臟MIR損傷治療策略的制訂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司，F(xiàn)lexStation 3),RT-PCR儀(美國Applied Biosystems公司，7300型)，化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)(美國伯樂公司，ChemiDoc XRS)。小鼠心肌細(xì)胞(CSC)購自上海撫生實業(yè)有限公司。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基(批號11965092)、DMEM培養(yǎng)基(批號11966025)、青/鏈霉素(P/S，批號15070063)、L-谷氨酰胺的衍生物(Glut MAX，批號35050061)、0.05%胰酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA，批號25300054)、胎牛血清(FBS，批號10099141)均購自美國Gibco公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，批號M2128)、堿性纖維生長因子(bFGF，批號GF003AF)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶1/2(p-ERK1/2，批號05-797R)、總細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的蛋白激酶1/2(t-ERK1/2，批號06-182)購自美國Millipore公司。PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號639505)購自寶生物工程有限公司。SYBRGreenMaster(批號4309155)購自美國ABI公司。丙二醛(MDA，批號MAK085)、超氧化物歧化酶(SOD，批號19160)試劑盒購自美國Sigma公司。蒲公英甾醇購自成都瑞芬思生物科技有限公司(批號127-22-0，純度大于98%，每份20 mg)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)及B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因引物由美國Invitrogen公司合成。GAPDH:F 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;R 5′-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3′。Caspase-3:F 5′-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3′;R 5′-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′。Bcl-2:F 5′-GCTGGGGATGACTTCTCTCGT-3′;R 5′-TGTGGCCCAGGTATGCAC-3′。

1.2方法

1.2.1模型制作 CSC細(xì)胞以2×105/孔的細(xì)胞濃度接種于6孔板，24 h后使用PBS清洗細(xì)胞，然后將不含葡萄糖和血清的DMEM培養(yǎng)基加入6孔板，在37 ℃，5%CO2，1%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后更換為含有10%胎牛血清(FBS)和高葡萄糖(4 500 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基在正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。正常對照組CSC細(xì)胞始終用含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。蒲公英甾醇治療組于缺血-再灌注損傷(I/R)開始前6 h將蒲公英甾醇加入6孔板。實驗分組如下：正常對照組、I/R組、蒲公英治療組(蒲公英甾醇+I/R組)和陽性對照組(bFGF+I/R組)。蒲公英治療濃度分別為5、10、30 μmol/L。bFGF對細(xì)胞增殖具有明確的促進作用[4]，在本研究中作為陽性對照，使用劑量為20 μg/L。

1.2.2MTT測定 CSC細(xì)胞以0.5×104/孔種于96孔板，每孔加入0.2 mL培養(yǎng)基并給予不同處理，體外培養(yǎng)48 h，加入5 mg/mL的MTT在37 ℃作用4 h，去除培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL/孔，室溫下孵育10 min，使用酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度。細(xì)胞活力=(吸光度/溶劑空白對照組吸光度)×100%。

1.2.3RT-PCR測定 用于實驗的細(xì)胞加入Trizol裂解液，提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。cDNA加入引物建立擴增體系后按RT-PCR試劑盒說明書進行擴增。

1.2.4生化法測定SOD、MDA的表達(dá) CSC細(xì)胞去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，每孔加入0.1 mol/L的PBS和0.05 mmol/L的EDTA(pH 8.0) 1 mL，再加入1%的Triton-X 100 50 μL，孵育1 min，加入25%的磷酸(H3PO4)100 μL，4 ℃離心1 h，取上清液，按說明書測定MDA、SOD水平。

1.2.5Western blot分析 CSC細(xì)胞加入RIPA裂解液提取總蛋白并測定蛋白濃度，以40 ng蛋白濃度進行上樣。蛋白變性后在10%的分離膠上電泳。待溴酚藍(lán)剛跑出膠，停止電泳。進行轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗p-ERK1/2(1∶2 000)，t-ERK1/2(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜，次日洗去一抗,加入二抗孵育1 h。洗去二抗，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。凝膠成像儀Image Lab拍照，Image J軟件檢測灰度值。

2 結(jié) 果

2.1CSC細(xì)胞活力 MTT測試發(fā)現(xiàn)，與正常對照組(0.651±0.085)比較，I/R組(0.418±0.059)細(xì)胞活力降低(P<0.05)，bFGF+I/R組(1.023±0.062)細(xì)胞活力明顯增加(P<0.01)。各劑量蒲公英甾醇組細(xì)胞活力提高，其中30 μmol/L蒲公英甾醇(0.894±0.065)為最優(yōu)選擇(P<0.05)。

2.2CSC細(xì)胞Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA 與正常對照組相比，I/R組Caspase-3 mRNA表達(dá)增加(P<0.01)。與I/R組比較，各劑量蒲公英甾醇治療均使CSC損傷模型Caspase-3 mRNA表達(dá)減少，10、30 μmol/L蒲公英甾醇組與I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組相比，bFGF+I/R組Caspase-3 mRNA表達(dá)減少(P<0.01)。與正常對照組相比，I/R組Bcl-2 mRNA表達(dá)減少(P<0.01)。與I/R組比較，各劑量蒲公英甾醇組Bcl-2 mRNA均表達(dá)回升，30 μmol/L蒲公英甾醇組與I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組相比，bFGF+I/R組Bcl-2 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組CSC細(xì)胞Caspase-3 mRNA及 Bcl-2 mRNA比較

a：P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.01，c：P<0.05，與I/R組比較

2.3CSC細(xì)胞MDA及SOD變化 與正常對照組相比，I/R組MDA水平提高(P<0.01)。與I/R組比較，bFGF+I/R組MDA水平降低(P<0.01)，各劑量蒲公英甾醇組MDA水平降低，其中10、30 μmol/L蒲公英甾醇組與I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常對照組相比，I/R組SOD水平降低(P<0.01)。與I/R組比較，bFGF+I/R組SOD水平增高(P<0.01)，各劑量蒲公英甾醇組SOD水平增高，30 μmol/L蒲公英甾醇組與I/R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組CSC細(xì)胞MDA，SOD水平比較

a：P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.01，c：P<0.05，與I/R組比較

圖1 不同研究組CSC細(xì)胞中ERK1/2蛋白表達(dá)水平

2.4氧化損傷CSC細(xì)胞ERK1/2表達(dá) 與正常對照組(1.020±0.098)相比，I/R組(0.647±0.087)p-ERK1/2與t-ERK1/2比值降低。與I/R組比較，30 μmol/L蒲公英甾醇組(0.894±0.092)p-ERK1/2與t-ERK1/2比值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

3 討 論

蒲公英是一種無毒且具有多種活性的天然藥物，蒲公英甾醇是應(yīng)用較為廣泛的蒲公英提取物。已有報道表明蒲公英甾醇在動物模型中發(fā)揮抗炎作用[5]，可以通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)抑制氧化損傷導(dǎo)致的肺組織炎癥[6]， 蒲公英甾醇通過抑制血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)和分化集落因子80(CD80)的表達(dá)對H2O2損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡等保護作用[7]。蒲公英甾醇通過調(diào)控ERK1/2和p38信號通路，抑制一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)對脂多糖損傷的巨噬細(xì)胞發(fā)揮保護作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)蒲公英甾醇通過激活ERK1/2信號途徑對I/R的CSC細(xì)胞發(fā)揮保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，I/R所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致CSC細(xì)胞活力降低，凋亡基因Caspase-3 mRNA水平提高，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平降低。蒲公英甾醇治療可以緩解I/R所致的CSC細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，使細(xì)胞活力恢復(fù)，降低凋亡基因Caspase-3 mRNA水平，提高抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平。

I/R導(dǎo)致CSC細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增多，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強[9]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末代謝產(chǎn)物，MDA水平可反應(yīng)氧化損傷程度[10]。SOD能夠清除代謝過程中的清除氧自由基，是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[11]。因此降低MDA水平，提高SOD水平在CSC細(xì)胞I/R的治療中具有積極意義[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致CSC細(xì)胞MDA水平提高，SOD水平降低，蒲公英甾醇治療降低MDA水平，提高SOD水平，可以緩解I/R所致的CSC細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，對CSC細(xì)胞具有積極的保護作用。

ERK是第1個被確定識別并克隆的MAPK基因，目前研究較多的是ERK1和ERK2，ERK1/2主要與細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖、凋亡、分化、遷移等生物學(xué)行為有關(guān)[13-14]。ERK進入細(xì)胞核激活A(yù)P-1、ELk-1、SAP等引起相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血-再灌注損傷所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致CSC細(xì)胞p-ERK1/2與t-ERK1/2比值降低，蒲公英甾醇治療使p-ERK1/2與t-ERK1/2比值增加，因此本研究認(rèn)為蒲公英甾醇通過調(diào)控ERK1/2表達(dá)對I/R的CSC細(xì)胞發(fā)揮保護作用。

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