一株對氯酚降解菌的篩選及降解特性

鄭曉寧

（無棣縣環(huán)境監(jiān)測站，山東 無棣 251900）

氯取代酚屬典型的難降解有機物，也是潛在的內(nèi)分泌干擾物，其中的很多化合物被認為具有致癌、致畸、致突變和遺傳毒性，美國環(huán)境保護局（USEPA）和我國都將氯取代酚列為優(yōu)先控制有毒污染物[1]。但氯酚作為一類非常重要的工業(yè)有機化合物，被廣泛應用于染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑和殺菌劑等化合物的生產(chǎn)中，全球每年的氯酚生產(chǎn)量約為2×105t[2]。氯取代酚的大量生產(chǎn)與排放導致水質(zhì)和土壤的嚴重污染[3]。由于該類化合物的芳香環(huán)結(jié)構以及氯取代基使得氯酚類化合物具有很強的抗降解能力，傳統(tǒng)的物化和生化方法難以對該類化合物進行有效處理[4]。在實際廢水中，氯取代酚經(jīng)常與其他污染物質(zhì)共同存在，其他有毒化合物的存在會抑制微生物的活性，增加氯取代酚的生物降解難度[5-6]。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

基礎鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 水1 L，pH 7.0～7.2。菌株降解試驗時，所用基礎鹽培養(yǎng)基中添加終濃度為1%的葡萄糖。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 L，pH7.0～7.2。固體培養(yǎng)基在其中加入2%的瓊脂粉。所有培養(yǎng)基使用前均在121℃下濕熱滅菌20 min。

酵母粉、蛋白胨、瓊脂等購自北京奧博星生物技術有限公司；液相色譜用甲醇為色譜純，購自上海星可生化有限公司；對氯酚標樣為色譜純，購自安徽合肥融宇生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 菌株的分離與純化

將采自山東無棣的某制革廢水用無菌水梯度稀釋，涂布LB平板，挑取長出的菌落在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有50 mg/L對氯酚的基礎鹽培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min的搖床上培養(yǎng)2 d，測定培養(yǎng)基中的對氯酚濃度，用紫外掃描儀通過波長掃描驗證菌株降解對氯酚的效果。將有降解效果的菌株通過平板劃線方法純化后開展相關試驗。

1.3 對氯酚的分析測定

菌株篩選過程中對氯酚降解能力的測定采用紫外掃描法：紫外掃描儀型號為UV-2300（上海天美科學儀器有限公司）；取1 mL培養(yǎng)液到1.5 mL離心管，于12000 r/min離心1 min，取上清液0.5 mL加基礎鹽培養(yǎng)基至終體積3 mL，于200～300 nm波長處連續(xù)掃描測定，特征吸收峰為281 nm。根據(jù)接菌與不接菌的樣品間的差異，確定菌株的降解效果。

降解試驗過程中對氯酚的測定采用液相色譜法：高效液相色譜儀為Waters Alliannce-2695型，配Waters SunFire C18 （4.6 nm×250 mm）色譜柱。流動相為甲醇:水（7:3，v:v），流速為0.7 mL/min，檢測波長為200～300 nm，對氯酚的定量波長為281 nm，進樣量20 μL，采用外標法按峰面積定量。其他化合物的定量波長統(tǒng)一采用260 nm，其他條件同對氯酚濃度的測定。

對氯酚降解率的計算公式為：

式中，Ct是接菌樣品中的對氯酚終濃度；Cc是指對照（相同培養(yǎng)條件但未接入降解菌）樣品中的對氯酚濃度；Y是指對氯酚的降解率。

對氯酚降解速率的計算公式為：

式中，Ct是接菌樣品中的對氯酚終濃度；Cc是對氯酚初始濃度；t為Cc和Ct取樣時間；Y為菌株降解對氯酚的平均速率。

1.4 菌株降解對氯酚試驗

降解試驗所用的菌懸液是指在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后期（種子液OD600約為5.0）的培養(yǎng)液，所有實驗均在250 mL錐形瓶中進行，若無特殊說明，對氯酚的初始濃度為100 mg/L，接種量為2%（v：v）。接種后，樣品放于30℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)，定時取樣測定其中的對氯酚濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解曲線試驗

在100 mL的基礎鹽培養(yǎng)基中加入對氯酚，使對氯酚的終濃度為100 mg/L。在培養(yǎng)基中接入2 mL的菌懸液，放置于30℃、150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)，定時取樣。上述試驗以不接任何菌株的樣品為對照，結(jié)果如圖1所示。試驗結(jié)果表明，與未接入ZQ-1的對照組相比，加入ZQ-1可使培養(yǎng)液中的對氯酚濃度明顯降低，48 h后幾乎全部降解，說明菌株ZQ-1能夠降解對氯酚；但在此過程中培養(yǎng)液的OD600沒有明顯變化，說明菌株不能以對氯酚進行生長。另外，接入ZQ-1，培養(yǎng)基的顏色變?yōu)楹稚?，隨著培養(yǎng)時間的延長，褐色會加深。而對照和空白（接入ZQ-1但不加對氯酚）樣品則沒有這種顏色產(chǎn)生，這可能是菌株ZQ-1降解對氯酚的過程中產(chǎn)生了一種新物質(zhì)，從而導致顏色變化。

圖1 菌株ZQ-1降解對氯酚的曲線

2.2 環(huán)境條件對菌株降解對氯酚的影響

2.2.1 pH對菌株降解對氯酚的影響

pH值可以影響酶的活性、菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及菌體細胞的結(jié)構，從而影響菌體的生長和反應活性。用NaOH和HCl調(diào)節(jié)無機鹽培養(yǎng)基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，滅菌后加入對氯酚，使對氯酚的終濃度為100 mg/L。接入菌株ZQ-1，置于30℃、150～170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)48 h時取樣，測定對氯酚濃度。結(jié)果表明，菌株ZQ-1在pH＝6.0～8.0時能較好地降解對氯酚。

2.2.2 溫度對菌株降解對氯酚的影響

將菌株ZQ-1接種于含對氯酚的無機鹽培養(yǎng)基中，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下恒溫培養(yǎng)，對氯酚的初始濃度為100 mg/L，24 h后取樣測定培養(yǎng)液中的對氯酚濃度。結(jié)果表明，35℃時該菌株降解對氯酚的效率最高，可統(tǒng)一達到70%。

2.3 對氯酚的初始濃度對菌株降解對氯酚的影響

在基礎鹽培養(yǎng)基中加入對氯酚，使對氯酚的終濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L，按2%的接種量向其中接入降解菌株的菌懸液。12 h、24 h、36 h和48 h取樣測定培養(yǎng)培養(yǎng)液中的對氯酚濃度。結(jié)果表明，對氯酚初始濃度為200 mg/L時，菌株降解對氯酚的速率最快。

2.4 菌株的降解譜試驗

在基礎鹽培養(yǎng)基中分別添加苯酚、對氯酚、對甲酚、鄰甲酚、1-萘酚、吡啶、間甲酚、2,4-二氯酚、3,5-二硝基酚、吩噻嗪、3,5-二硝基水楊酸和對硝基酚。接入菌株ZQ-1，結(jié)果表明，該菌對苯酚和對氯酚有較好的降解效果，對其他芳香族化合物無明顯降解效果。

3 結(jié)論

從制革廢水中分離到1株降解對氯酚的棒狀菌屬細菌ZQ-1。該菌株降解對氯酚的最適pH值為6.0～8.0，最適溫度為35～40℃，對氯酚的初始濃度與菌株降解速率呈負相關，對對氯酚和苯酚具有較強的降解能力。

參考文獻

1 YOUNES M.Specific issues in health risk assessment of endocrine disrupting chemicals and international activitie[J].Chemosphere，1999，39（8）：1253-1257.

2 姜 梅，牛世全，展惠英，等.氯酚類化合物的微生物降解研究進展[J].應用生態(tài)學報，2003，14（6）：1003-1006.

3 郜瑞瑩，王建龍.pH對厭氧顆粒污泥吸附4-氯酚的影響[J].環(huán)境科學，2007，28（4）：791-794.

4 Peru-Titus M，Garcia-Molina V，Banos M A，etal.Degradation of chlorophenols by means of advanced oxidation processed[J].Applied Catalysis B Environmental，2004，47（4）：219-256.

5 全向春，施漢昌，王建龍，等.苯酚存在對生物強化系統(tǒng)降解2,4-二氯酚的影響[J].環(huán)境科學，2003，24（1）：75-79.

6 陳 皓，陳 玲，黃愛群，等.重金屬對2-氯酚厭氧降解的抑制動力學研究[J].中國環(huán)境科學，2010，30（3）：328-332.