乳消平丸高效液相指紋圖譜的建立及主要成分的測(cè)定

李 茜，張 琛，張建春1,#(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； .中國(guó)人民解放軍第一醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

根據(jù)中醫(yī)理論，乳腺增生癥乃內(nèi)傷七情所致，多由肝氣郁結(jié)引起，由氣及血，以致氣血結(jié)聚，治療以疏肝解郁、軟堅(jiān)散結(jié)為主。乳消平丸可軟堅(jiān)散結(jié)、疏肝解郁、清熱解毒和消腫療癰，對(duì)乳腺增生有良好的治療效果；該藥臨床使用十余年，總效率達(dá)到92%，且未見(jiàn)不良反應(yīng)發(fā)生，安全性高。但由于該藥處方中藥材較多，化學(xué)成分復(fù)雜，一般采用單一或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。目前，指紋圖譜已成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的鑒別中藥品種和評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的最有效手段[1-5]，能夠較好地顯示中藥制劑的整體情況。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，建立了乳消平丸的高效液相指紋圖譜，并測(cè)定其中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸4種主要有效成分的含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)乳消平丸更好的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290型高效液相色譜儀，包括Agilent 1290LC色譜工作站、G4 204 A四元泵、手動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C柱溫箱及G4 212 A紫外檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫科技公司)；BP221S 型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；沃特浦實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 藥品與試劑

咖啡酸(批號(hào)：110885—200102)，阿魏酸(批號(hào)：110773—200611)，甘草苷(批號(hào)：111610—201106)和甘草酸銨(批號(hào)：110731—201317)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所。乳消平丸[解放軍第一醫(yī)院自制制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：蘭制字(2011)F01 019號(hào)，批號(hào)：20160318—20160328]。甲醇和乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，10%A；16～30 min，15%A；31～40 min，20%A；41～50 min，25%A；51～60 min，30%A)；流速為1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液：精密稱取乳消平粉末5 g置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率：250 W，頻率：60 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成每1 ml含咖啡酸61 μg、阿魏酸91 μg、甘草苷46 μg和甘草酸銨88 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液：除去處方中的蒲公英、當(dāng)歸和甘草后，按制備工藝制備陰性樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成陰性溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各1、2、4、6及8 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，即得對(duì)照品混合溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，應(yīng)用Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 咖啡酸、阿魏酸和甘草苷的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Results of linearity of caffeic acid, ferulic acid and liquiritin

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取乳消平丸(批號(hào)：20160318)5 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在室溫下(25 ℃)放置0、2、4、8、12及24 h后進(jìn)樣測(cè)定，分別以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨為參照峰計(jì)算指紋圖譜中峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.41%，相對(duì)峰面積RSD為0.49%～0.97%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.32%、1.19%、1.18%和1.11%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 精密度試驗(yàn)：取乳消平丸(批號(hào)：20160319)5 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨為參照峰計(jì)算指紋圖譜中峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.57%，相對(duì)峰面積RSD為0.01%～0.03%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸的RSD分別為1.13%、1.02%、1.72%和1.68%，表明精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取乳消平丸(批號(hào)：20160318)6份，每份約5 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨為參照峰計(jì)算指紋圖譜中峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.01%～0.36%，相對(duì)峰面積RSD為0.19%～0.92%，且咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為 1.41%、1.47%、1.49%和1.90%，表明重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立和相似度分析

取10批乳消平丸(批號(hào)：20160318—20160327，標(biāo)記為S1—S10)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”，建立乳消平丸指紋圖譜的共有模式，獲得了30個(gè)共有峰。計(jì)算指紋圖譜中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比。以共有模式為參照，計(jì)算樣品與共有模式之間的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。10批樣品的色譜疊加圖見(jiàn)圖1。

2.5 乳消平丸中4種成分的測(cè)定

2.5.1 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的同一批乳消平丸樣品(批號(hào)：20160318)約2.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入阿魏酸、咖啡酸、甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表3。

表2 10批樣品指紋圖譜的相似度分析結(jié)果Tab 2 Results of similarity analysis on 10 batches of samples in fingerprint chromatography

圖1 10批乳消平丸高效液相色譜疊加圖Fig 1 Stacking chart of HPLC of 10 batches of Ruxiaoping pills

2.5.2 含量測(cè)定：取乳消平丸3批(批號(hào)：20160318—20160320,標(biāo)記為S1—S3)，按照“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定乳消平丸中咖啡酸、阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨的含量，見(jiàn)表4，色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，咖啡酸的出峰時(shí)間為10.95 min，阿魏酸為19.37 min，甘草苷為22.46 min，甘草酸銨為24.55 min。供試品溶液中都有顯著峰與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)，且陰性中無(wú)此吸收峰，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾。

3 討論

乳消平丸主要由瓜蔞、蒲公英、昆布、荔核、海藻、當(dāng)歸、浙貝母、元胡、穿山甲、天仙子及甘草組成。本方中的瓜蔞、蒲公英、昆布、海藻、浙貝母及荔枝核等清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)的藥材為君藥；當(dāng)歸、元胡及穿山甲可補(bǔ)血活血、通經(jīng)下乳，為臣藥；天仙子平喘、安神，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。本研究選取蒲公英、當(dāng)歸和甘草的主要成分苦咖啡酸、甘草苷、甘草酸和阿魏酸作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分[9-13]，研究方法可操作性強(qiáng)，能控制乳消平丸的質(zhì)量。中醫(yī)藥在預(yù)防和治療乳腺增生癥方面，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與潛力，在內(nèi)科辨證論治的基礎(chǔ)上結(jié)合外治療法不失為治療該病的良法。相信隨著研究的不斷深入，中醫(yī)學(xué)對(duì)乳腺增生癥的認(rèn)識(shí)及防治將會(huì)不斷地豐富和發(fā)展，為中醫(yī)學(xué)的發(fā)展及婦女健康保健做出更大的貢獻(xiàn)。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of sample recovery tests

表4 3批樣品中咖啡酸、阿魏酸和甘草苷的含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Results of content determination of caffeic acid, ferulic acid and liquiritin in 3 batches of samples

1.咖啡酸；2.阿魏酸；3.甘草苷；4.甘草酸；A. 對(duì)照品混合溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液1.caffeic acid；2.ferulic acid；3.licorice glycosides；4.glycyrrhizic acid；A. contrast the mixture solution；B.test solution；C.negative control solution圖2 乳消平丸的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of Ruxiaoping Pills

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