河南省牛支原體的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

徐引弟，李海利，焦文強(qiáng)，王治方，王克領(lǐng)，索延樂，宋振宇

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州450002； 2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002； 3.濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 濟(jì)源 459000)

牛支原體 (Mycoplasmabovis) 主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)和不孕等疾病。自1961年美國報(bào)道以來，牛支原體及其相關(guān)疾病迅速擴(kuò)散至世界各個(gè)國家和地區(qū)，對世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了極大的威脅和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。2008 年以來，我國多地相繼發(fā)生并廣泛流行的以發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕為主要癥狀，以壞死性肺炎為主要病變的牛呼吸道傳染病，被確診為牛支原體感染所致的牛支原體肺炎[5-8]。由于牛支原體缺乏細(xì)胞壁，對廣譜抗生素不敏感，對敏感藥物極易產(chǎn)生耐藥性，因此，常規(guī)藥物治療該病效果差，且病情反復(fù)、無有效疫苗進(jìn)行預(yù)防[9-10]。疫苗免疫是預(yù)防牛支原體引起的相關(guān)疾病最有效的方法，而獲得毒力強(qiáng)、免疫原性好的菌株，對于該病預(yù)防有重大的意義。鑒于此，從河南省各地養(yǎng)牛場分離鑒定牛支原體，并對其中1株分離自濟(jì)源市某大型奶牛場的牛支原體進(jìn)行生物學(xué)特性研究，旨在對河南省牛支原體的流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查，為牛支原體的診斷、疫苗的研制開發(fā)以及牛支原體病的綜合防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料與毒株

2016年1—12月，從河南省發(fā)生肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的牛場采集肺、鼻拭子、牛奶、子宮積液等病料共計(jì)257份。其中1份病料采集自濟(jì)源市某大型奶牛場，該場發(fā)生主要以2～3月齡為主，癥狀為犢牛流涕、咳嗽、呼吸困難、減食或不食、反芻減少或廢絕、消瘦，嚴(yán)重的發(fā)生死亡，采集因發(fā)生重癥肺炎呼吸困難死亡的2月齡黑白花奶牛的肺臟。牛支原體HB0801株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)郭愛珍教授惠贈。

1.2 主要試劑

PPLO肉湯粉、TSA(Tryptic soy agar，胰蛋白大豆瓊脂)、酵母粉、瓊脂粉購自美國BD公司；葡萄糖、酚紅購自上海國藥集團(tuán)公司；MEM、馬血清購自Hyclone公司；青霉素購自華北制藥集團(tuán)公司；精氨酸購自Roche公司；2×Direct PCR Mix、Hot StartTaq酶、Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

PPLO液體培養(yǎng)基：PPLO肉湯粉10.5 g、葡萄糖2.5 g、酵母粉2.5 g，溶于440 mL超純水中，115 ℃滅菌15 min，加MEM 5 mL、馬血清50 mL、8萬U青霉素5 mL、10%精氨酸10 mL和1% 酚紅500 μL。PPLO固體培養(yǎng)基:含1.5% 瓊脂粉的PPLO液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基于115 ℃滅菌15 min后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TSA 固體培養(yǎng)基：稱取40 g TSA培養(yǎng)基溶于1 000 mL水中，121 ℃高壓滅菌15 min。溫度下降到大約45 ℃時(shí)，加入50 mL犢牛血清，混勻之后傾倒無菌平皿，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中牛支原體16S rRNA基因設(shè)計(jì)1對通用引物，用于牛支原體的擴(kuò)增。上游引物P1：5′-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3′，下游引物P2：5′-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3′， 預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段1 390 bp。同時(shí)設(shè)計(jì)1對牛傳染性胸膜肺炎支原體的特異性引物，引物序列如下,P3: 5′-ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG-3′，P4: 5′-CTGATTATGATGACAGTGGTCA-3′，擴(kuò)增片段大小為277 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 牛支原體的分離培養(yǎng)

無菌條件下將采集的肺組織切成小塊，加入2 mL PBS，碾磨后5 000 r/min離心3 min，上清用0.45 μm濾膜過濾，加入有酚紅的PPLO液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后，轉(zhuǎn)接至PPLO液體培養(yǎng)基傳代，直至液體顏色由紅色變?yōu)辄S色，取100 μL涂布PPLO固體培養(yǎng)基表面，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～5 d后，肉眼觀察生長情況并在低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.6 牛支原體的鑒定

將疑似支原體菌落接種PPLO液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，收集菌體，用DNA提取試劑盒提取DNA，分別用P1、P2和P3、P4擴(kuò)增并測序鑒定。以牛支原體HB0801株為陽性對照。

1.7 生物學(xué)特性試驗(yàn)

將分離自濟(jì)源某牛場死亡奶牛肺的牛支原體菌株命名為HNMB1，于2016年11月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC No：13295)。

1.7.1 增殖試驗(yàn) 將分離鑒定好的菌株接種于PPLO液體培養(yǎng)基中，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，低倍鏡下活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算原液菌體濃度。

1.7.2 毒力試驗(yàn) 供試牛為2月齡健康的黑白花奶牛，公、母牛各4頭。試驗(yàn)設(shè)對照組、試驗(yàn)組，每組供試動(dòng)物各包括隨機(jī)分組的公牛2頭、母牛2頭。將鑒定好的菌株接種于PPLO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，計(jì)數(shù)并調(diào)整菌液濃度至108cfu/mL，試驗(yàn)組動(dòng)物通過喉氣管接種3 mL支原體液體培養(yǎng)物，對照組動(dòng)物通過喉氣管接種3 mL滅菌的PPLO液體培養(yǎng)基。試驗(yàn)期為15 d，每天觀察試驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，并測量體溫，如有供試動(dòng)物死亡則立即進(jìn)行剖殺，觀察呼吸道病變并采集病料。于15 d后試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖殺所有試驗(yàn)動(dòng)物。

1.7.3 免疫原性試驗(yàn) 將牛支原體分離菌接種到PPLO液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后收取培養(yǎng)物，測定濃度，調(diào)整疫苗菌液中的菌數(shù)為2×109cfu/mL，加入甲醛，使其終體積分?jǐn)?shù)為0.2%，于37 ℃滅活12 h。疫苗菌液滅活后與氫氧化鋁佐劑按體積比3∶2混勻，制得牛支原體滅活疫苗。

選取10頭30日齡健康黑白花奶牛，分為2組。疫苗組：5頭30日齡頸部肌肉注射2 mL制備的疫苗，60日齡再次注射制備的疫苗2 mL；對照組：5頭同樣注射2 mL滅菌生理鹽水2次。1個(gè)月后用109cfu的分離菌采取氣管注射的攻毒方式進(jìn)行攻毒。攻毒后第2天開始每天采集鼻拭子，第10天開始每3 d采一次鼻拭子，鼻拭子過濾后，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在攻毒后40 d，剖檢供試動(dòng)物，采集喉拭子、肺臟等進(jìn)行牛支原體分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛支原體的分離培養(yǎng)

肺組織培養(yǎng)3 ～ 5 d、傳代1～ 3代后，PPLO液體培養(yǎng)基逐漸變黃，PPLO平板上肉眼見極小的針尖狀菌落，低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，形態(tài)多樣，有典型的支原體“煎荷包蛋樣”(圖1)。吉姆薩染色，油鏡下觀察支原體菌體形態(tài)，為多形態(tài)，呈球菌樣、彎曲的絲狀、螺旋狀(圖2)。

圖1 牛支原體菌落顯微鏡下形態(tài)

2.2 牛支原體的PCR鑒定

將分離菌提取DNA擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，P1、P2擴(kuò)增出符合預(yù)期大小片段，經(jīng)測序與牛支原體 HB0801株(GenBank No：CP007591)同源性均在95%以上。P3、P4未擴(kuò)增出片段，證明所分離的毒株為牛肺炎支原體。

圖2 牛支原體菌體吉姆薩染色顯微鏡下形態(tài)

M:DL 2000 DNA Marker； 1：引物P1、P2擴(kuò)增陽性對照；2：引物P1、P2擴(kuò)增分離菌；3：引物P3、P4擴(kuò)增分離菌圖3 牛支原體PCR鑒定結(jié)果

結(jié)合以上結(jié)果，共從257份病料中分離鑒定出87株牛支原體，分離率達(dá)33.85%。

2.3 牛支原體的生物學(xué)特性

2.3.1 增殖試驗(yàn)結(jié)果 菌株經(jīng)PPLO液體培養(yǎng)后，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌液濃度為3.2×109cfu/mL，可見，分離菌株在培養(yǎng)基中高效增殖。

2.3.2 毒力試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組動(dòng)物在接種支原體24 h后表現(xiàn)出呼吸道癥狀，分泌物增多、咳嗽，體溫升高，不食，反芻停止，7 d后死亡1頭，10 d后死亡2頭，共死亡3頭，致死率為75%。對照組動(dòng)物在試驗(yàn)期間體溫正常，且無明顯的呼吸道癥狀。試驗(yàn)結(jié)束后剖殺試驗(yàn)組動(dòng)物，同時(shí)剖殺4頭對照組動(dòng)物，采集病料，進(jìn)行支原體分離。試驗(yàn)組剖檢胸膜有大量纖維素樣滲出，肺隔葉部分出現(xiàn)肉樣實(shí)變，胸腔積液，對照組剖檢均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。對照組的4份病料均未分離到支原體，試驗(yàn)組的4份病料中均分離到牛支原體，菌落形態(tài)表現(xiàn)為“煎荷包蛋樣”，PCR鑒定結(jié)果與分離菌株一致。

2.3.3 免疫原性試驗(yàn)結(jié)果 疫苗組與對照組奶牛有明顯的差異，攻毒后，對照組第2天開始出現(xiàn)臨床癥狀，體溫升高、流涕、呼吸困難、減食甚至絕食、反芻停止，7 d后開始死亡，2周后共死亡4頭。而疫苗組攻毒后，只有輕微的體溫升高、流涕，飲食、反芻正常，未出現(xiàn)死亡。攻毒后采集鼻拭子檢測牛支原體，疫苗組隨著時(shí)間的推移，排菌持續(xù)減少，攻毒后第40天未檢測到牛支原體。而對照組持續(xù)排菌，直到攻毒后第40天仍可檢測到牛支原體。剖檢發(fā)現(xiàn)，對照組動(dòng)物的肺臟與胸腔嚴(yán)重粘連，胸腔積液，肺臟實(shí)變，而疫苗組動(dòng)物無明顯變化。從肺臟分離牛支原體，對照組100%分離到牛支原體，而疫苗組分離率為0，說明分離菌具有良好的免疫原性，對大劑量的野毒攻擊有良好的保護(hù)效果，攻毒保護(hù)率為100%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)于2016年1—12月在河南省發(fā)生肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的牛場采集肺、鼻拭子、牛奶、子宮積液共計(jì)257份，分離鑒定出87株牛支原體。對其中1株分離自濟(jì)源市某大型奶牛場的牛支原體進(jìn)行了生物學(xué)特性研究。該分離株在PPLO液體培養(yǎng)基中增殖滴度高，達(dá)3.2×109cfu/mL，對牛的致死率為75%，具有較強(qiáng)的致病力。采用該分離株制備的疫苗免疫對牛支原體攻毒保護(hù)率為100%，具有良好的免疫原性，可以作為下一步診斷試劑和疫苗的候選毒株。

牛支原體感染引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)和不孕等[11-12]，牛支原體引起的肺炎臨床癥狀和病理剖檢變化與絲狀支原體引起的牛傳染性胸膜肺炎類似，因此，病原的分離鑒定是確診疫情的最好辦法。在進(jìn)行支原體培養(yǎng)同時(shí)，也做了其他細(xì)菌的分離，結(jié)果未有其他細(xì)菌生長，只有非常純的典型的支原體生長，通過保守的16S rRNA基因的擴(kuò)增及測序比對，與報(bào)道的其他牛支原體同源性極高，與牛鼻支原體、絲狀支原體、無乳支原體等同源性差。因此，分離的病原均為牛支原體，而不是絲狀支原體或其他支原體。

我國多地區(qū)均有牛支原體感染的情況報(bào)道。2008年，石磊等[13]報(bào)道湖北省發(fā)生了肉牛傳染性支原體肺炎；郭亞男等[14]研究發(fā)現(xiàn)，2013年寧夏牛支原體血清學(xué)陽性率為32.17%，2014年為26.52%，2015年為44.97%；李坤等[15]報(bào)道了2013年西藏部分地區(qū)黃牛支原體血清學(xué)陽性率為23.59%；感染率最高的為新疆，李靜等[16]報(bào)道新疆部分規(guī)?；膛?011—2012年牛支原體血清學(xué)陽性率為86.3%。從本研究分離鑒定結(jié)果看，河南省牛支原體的感染情況十分嚴(yán)重，陽性率高達(dá)33.85%。對于牛支原體應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視，加強(qiáng)牛群引進(jìn)管理和檢疫，加強(qiáng)牛群飼養(yǎng)管理，發(fā)現(xiàn)疫情，及早診斷，及早治療，才能有效控制該病[17]。

增殖滴度、毒力和免疫原性是決定毒株是否適合作為疫苗毒株的最為關(guān)鍵的因素。本試驗(yàn)中的毒株分離自因典型肺炎癥狀死亡的牛，在液體培養(yǎng)基中增殖滴度高，通過牛支原體感染方案，感染牛迅速出現(xiàn)了典型肺炎的癥狀，剖檢后內(nèi)臟出現(xiàn)典型病變，且分離到牛支原體，確診病原為牛支原體，且所分離牛支原體的毒力強(qiáng)，免疫原性好，可以作為疫苗的候選毒株，為進(jìn)一步深入研究和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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