Cd脅迫對不同砧穗組合葡萄植株光合作用、膜脂過氧化和抗氧化酶活性的影響

李小紅，李輝信，任俊鵬，李運景，吳亞蓓，馬曉青，陶建敏

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002； 2.南京農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境科學學院，江蘇 南京 210095； 3.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇 句容 212400；4.南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，江蘇 南京 210095)

目前，由于工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，人類的各種活動比如采礦、車輛運載、污水灌溉、化肥施用等引起的重金屬污染問題日益嚴重，研究表明，我國耕地重金屬污染面積占耕地總面積的16.7%左右，Cd污染概率為25.2%，遠超過Ni、Hg、As和Pb等其他幾種重金屬[1-3]。Cd不是植物生長發(fā)育的必需元素，但是易于被植物吸收并累積,對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生一系列的影響，比如抑制植物生長、降低植物光合作用、干擾植物礦質(zhì)營養(yǎng)吸收，導致作物產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降[4-13]。Cd積累不僅對植物生長造成影響，并且能夠沿食物鏈富集進入人體，引起身體機能失調(diào)和一系列疾病，比如痛痛病、癌癥和中毒性腎損傷[14-15]。Cd作為毒害較強且污染嚴重的重金屬，引起了國內(nèi)外學者的關(guān)注和研究。

果農(nóng)為了提高果品質(zhì)量和產(chǎn)量，長期使用農(nóng)藥、化肥，加之不當?shù)霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式，造成許多果園土壤質(zhì)量下降，微生物數(shù)量減少，甚至有的果園土壤還出現(xiàn)了重金屬累積[16-18]。果園土壤被Cd污染后，輕者阻礙果樹的生長和發(fā)育，影響果品的產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴重者導致果品富集Cd，并通過食物鏈進入人體，給人類健康帶來潛在的風險。

葡萄生產(chǎn)中，通過嫁接可以調(diào)整栽培品種的生長勢、成熟期、產(chǎn)量和果實品質(zhì)[19-21]。大量研究發(fā)現(xiàn)，嫁接還能夠提高果樹和蔬菜等園藝作物對逆境脅迫如水分脅迫、鹽分脅迫、有機物和重金屬污染[22-25]的適應(yīng)能力。但是，關(guān)于嫁接對重金屬脅迫下果樹生長、膜脂過氧化產(chǎn)物的累積及抗性機制方面的影響研究較少，而關(guān)于Cd脅迫條件下嫁接對葡萄植株影響的研究還未見報道。因此，以不同的葡萄砧木嫁接生產(chǎn)上的優(yōu)良早熟葡萄品種矢富羅莎，研究不同砧穗組合在Cd脅迫下的生長和生理響應(yīng)差異，以期為葡萄抗性砧木的選擇提供初步理論支撐，并為葡萄安全、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試土壤和葡萄植株材料

試驗在南京農(nóng)業(yè)大學滄波門葡萄實驗基地進行。選取7個葡萄砧木品種(巨峰、5BB、110R、99R、華佳8號、8B、SO4)作為試驗材料，于3月中旬將生長相對一致的7個品種砧木苗和矢富羅莎扦插苗定植于塑料盆(35 cm×30 cm)中，待砧木苗生長至3～4片葉時，采用綠枝嫁接矢富羅莎，分別記作Y/巨峰、Y/5BB、Y/110R、Y/99R、Y/華佳8號、Y/8B和Y/SO4，以矢富羅莎扦插苗為對照。

盆土所用土壤來自南京農(nóng)業(yè)大學滄波門葡萄試驗基地，土壤類型為黃棕壤，pH值6.8，有機碳含量為6.86 g/kg，陽離子交換量為10.79 cmol/kg，速效磷含量為16.2 mg/kg，Cd的背景值為0.56 mg/kg。

1.2 試驗處理與設(shè)計

1.2.1 污染濃度的確定 預(yù)備試驗設(shè)置4個Cd水平，分別為2.5、5、15、25 mg/kg，以未添加Cd土壤為對照，共5個處理。試驗結(jié)果表明：25 mg/kg Cd處理水平下，葡萄植株生長遲緩、葉片變小、新梢節(jié)間變短，葡萄果粒小，不能正常著色，有僵果，嚴重影響樹體生長、果實正常發(fā)育和成熟；2.5、5 mg/kg 2個Cd處理水平下，葡萄植株生長狀況良好，與對照差異不明顯；15 mg/kg Cd處理水平下，葡萄植株生長狀況與對照相比，明顯受到影響，但未嚴重阻礙植株生長，果實能夠正常發(fā)育和成熟，由于試驗材料有限，最終確定Cd 15 mg/kg作為試驗處理。

1.2.2 試驗處理 在風干過篩后的土壤中加入CdCl2溶液，以模擬成15 mg/kg的Cd污染土壤，在常溫下熟化平衡2個月，然后裝入塑料盆，將3年生矢富羅莎葡萄苗栽入塑料盆中，每個處理重復(fù)4次。采用避雨栽培，常規(guī)土肥水管理和病蟲害防治。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 光合參數(shù)的測定 采用Li-6400(美國LI-COR公司生產(chǎn))光合測定儀，于5月31日(晴天)9：00—10：00進行測定，每個處理均選擇3株生長基本一致、無病蟲害的植株，取新梢部位第3～5節(jié)位的功能葉片進行凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)的測定。

1.3.2 葉綠素和丙二醛(MDA)含量的測定 葉綠素含量的測定采用丙酮提取法[26]：稱取0.1 g葡萄葉片，加入5 mL 80% 的丙酮溶液在黑暗條件下浸提，時間為48 h。MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法[27]。

1.3.3 酶活性的測定 超氧化物歧化酶(SOD)的活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定，過氧化物酶(POD)的活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶(CAT)的活性通過單位時間內(nèi)H2O2含量的變化來表示。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows 13.0軟件和EXCEL進行統(tǒng)計分析，顯著性差異水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧木嫁接對Cd脅迫下矢富羅莎葡萄葉片光合參數(shù)的影響

表1顯示，Cd脅迫下，矢富羅莎不同砧穗組合葡萄葉片的光合參數(shù)存在差異。嫁接苗葡萄葉片的Pn均高于自根苗，Y/巨峰和Y/華佳8號組合略高于對照自根苗，與對照差異不顯著，以Y/99R和Y/8B組合較高，分別為9.62、7.09 μmol/(m2·s)，分別是對照自根苗的4.74、3.49倍；矢富羅莎不同砧穗組合葡萄葉片的Tr存在顯著差異，以Y/99R和Y/110R組合較高，分別為2.84、1.47 mmol/(m2·s)；除Y/SO4組合外，所有嫁接組合葡萄葉片的Ci均顯著高于對照，其中以Y/99R和Y/巨峰組合最高，分別為對照的2.96、2.73倍。嫁接減輕了Cd脅迫對葡萄植株的光合作用和蒸騰作用的抑制程度，細胞間隙CO2供應(yīng)也更為充足。

表1 不同砧木嫁接對Cd脅迫下葡萄葉片光合參數(shù)的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 不同砧木嫁接對Cd脅迫下矢富羅莎葡萄葉片葉綠素和MDA含量的影響

Cd處理下，矢富羅莎不同砧穗組合葡萄的葉綠素含量存在差異(圖1)。以Y/巨峰、Y/華佳8號和Y/5BB嫁接組合的葉綠素含量較高，比對照自根苗葉片葉綠素含量分別提高了17.9%、14.9%和14.2%，Y/110R、Y/8B和 Y/SO4組合居中，比對照自根苗葉片葉綠素含量分別提高了9.7%、9.0%和7.5%，Y/99R略高于對照，與對照差異不顯著。這說明嫁接有效減輕了Cd脅迫對葡萄葉片光合色素的破壞。此外，與對照自根苗相比，嫁接減輕了Cd脅迫對葡萄植株葉片的膜脂過氧化損傷程度，降低了葡萄植株葉片的MDA 含量，所有嫁接組合葉片的MDA 含量均顯著低于對照，為對照葡萄葉片含量的35.0%～80.8%，其中以 Y/110R的下降幅度最大，為對照植株葡萄葉片含量的35.0%(圖2)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2同

圖2 不同砧木嫁接對Cd脅迫下葡萄葉片MDA含量的影響

2.3 不同砧木嫁接對Cd脅迫下矢富羅莎葡萄葉片抗氧化酶活性的影響

由表2可以看出，Cd脅迫下矢富羅莎不同砧穗組合葡萄葉片的抗氧化酶活性不同，Y/99R、Y/5BB組合葡萄葉片的SOD和CAT活性分別為9.35 U/g和 13.27 U/(g·min)、8.42 U/g和 9.92 U/(g·min)，均明顯高于對照和其他組合，POD活性以Y/110R、Y/99R和 Y/8B較高，Y/華佳8號和Y/5BB居中，Y/巨峰和Y/SO4 最低。除Y/110R、Y/8B、Y/巨峰和Y/華佳8號組合的SOD活性低于對照或與對照差異不顯著外，其他嫁接組合的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性均顯著高于對照自根苗。

表2 嫁接對Cd脅迫下葡萄葉片抗氧化酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

光合作用作為植物體內(nèi)極為重要的生理過程，也是植物對環(huán)境變化最為敏感的代謝過程，其強弱與植物生長發(fā)育、產(chǎn)量和抗逆性有著十分密切的關(guān)系，因而可用作判斷植物生長狀況和抗逆性強弱的指標[28]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，嫁接作為提高植物抗逆性的有效措施之一，能夠提高甜瓜幼苗對銅脅迫的耐性，減輕對甜瓜幼苗葉片光合色素的毒害，從而提高光合作用[29]。本研究表明，嫁接減弱了Cd脅迫對葡萄植株葉片光合色素的損傷程度，除Y/99R與對照自根苗差異不顯著以外，其他嫁接組合葡萄植株葉片的葉綠素含量均顯著高于自根苗。同時本研究結(jié)果顯示，葡萄嫁接苗在Cd脅迫下表現(xiàn)出較高的凈光合速率和蒸騰速率，細胞間隙CO2濃度也明顯高于自根苗，不同砧穗組合之間存在差異，其中以Y/99R、Y/110R和Y/5BB組合的較高。所以，嫁接減輕了Cd脅迫對葡萄葉片葉綠素含量、光合作用的損傷和抑制程度，從而減輕了對葡萄植株的毒害作用。

Cd脅迫能夠引起植物體內(nèi)活性氧自由基的過量產(chǎn)生，對植物細胞產(chǎn)生毒害作用，從而導致細胞膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，可與膜上蛋白質(zhì)結(jié)合，導致蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)產(chǎn)生交聯(lián)，嚴重損失和破壞細胞膜系統(tǒng)，MDA含量高低反映了膜脂的損傷程度[30-31]。研究表明，嫁接能夠減弱銅脅迫對甜瓜幼苗的膜脂過氧化損傷，減少MDA含量的累積[32]。本試驗的研究結(jié)果與此一致，在Cd脅迫條件下，嫁接葡萄苗葉片的MDA含量明顯低于自根苗，這表明嫁接葡萄苗膜脂過氧化的程度比自根苗輕，嫁接能夠減弱Cd脅迫對葡萄植株的膜脂過氧化損傷。

正常情況下植物體細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但是當植物受到Cd脅迫時，超氧陰離子產(chǎn)生速率升高、過氧化氫含量增加，引起植物細胞活性氧爆發(fā)，平衡被打破，最終使植物受到了氧化損傷[33-34]。SOD、POD和CAT等抗氧化酶類作為植物細胞中內(nèi)源活性氧的清除劑，能夠在逆境脅迫中清除過量的活性氧自由基，維持細胞內(nèi)的活性氧的代謝平衡，減輕對膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而在一定程度上減緩了逆境脅迫對植物的傷害[35]。本試驗結(jié)果顯示，在Cd脅迫條件下，所有嫁接組合的POD和CAT活性都顯著高于自根苗，這表明嫁接增強了葡萄植株對活性氧的清除能力，減輕了對質(zhì)膜的氧化損傷，從而提高了葡萄植株對Cd脅迫的耐受性。這與譚明明[29]在甜瓜上的研究結(jié)果一致。此外，本試驗中，Y/8B、Y/巨峰和Y/華佳8號葡萄植株的SOD活性低于自根葡萄植株，這可能是由于不同組合葡萄植株的抗氧化機制存在差異，Y/8B和Y/華佳8號表現(xiàn)出較高的POD活性。

研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜不同砧木嫁接苗在銅脅迫下抗氧化酶活性大小存在差異[29]，本試驗也得出了一致的結(jié)果，在Cd脅迫條件下，不同組合葡萄植株體內(nèi)的SOD、POD和CAT活性均存在差異。研究表明，作物對Cd的耐性具有明顯的種間和種內(nèi)差異[36]，Cd耐性植物種間和種內(nèi)差異與體內(nèi)抗氧化能力有關(guān)，本試驗結(jié)果表明，在Cd脅迫條件下，Y/99R 和Y/5BB 組合的SOD 和 CAT活性顯著高于其他組合，這與之前文獻報道的Y/99R 和Y/5BB 組合Cd積累濃度較低相一致[37]。

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