一株梭鱸源無乳鏈球菌的分離、鑒定及分子分型分析

趙長臣，江小燕，劉春花，張德峰，羅 霞，曾偉偉，陳總會，2，黃志斌

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 廣州 510380;2.廣州普麟生物制品有限公司 廣州 510380)

梭鱸(Luciopercalucioperca)原分布于咸海、黑海、波羅的海水系的河流、湖泊中，經(jīng)過多次繁殖已遍及歐洲各國，我國僅自然分布于新疆伊犁河水系和額爾齊斯河水系[1]。上世紀(jì)90年代我國梭鱸人工繁育獲得成功，至今東北、華北、華東、華南地區(qū)均有養(yǎng)殖，已成為我國重要的名優(yōu)淡水養(yǎng)殖魚類。梭鱸易發(fā)生車輪蟲、指環(huán)蟲等寄生蟲病害，但在魚苗或養(yǎng)成階段，抗病能力較強(qiáng)，不易患病，目前在我國尚未發(fā)現(xiàn)梭鱸病毒性及細(xì)菌性病害發(fā)生的報道。梭鱸為掠食性魚類，飼料以鮮活餌料魚為主，但近年來為了降低養(yǎng)殖成本，廣東順德等地出現(xiàn)了以冰鮮魚代替鮮活餌料魚的現(xiàn)象，加大了梭鱸感染外來病原微生物的潛在威脅。2017年3月廣東省佛山順德一工廠化養(yǎng)殖場出現(xiàn)梭鱸發(fā)病并死亡的現(xiàn)象，一口養(yǎng)殖了4 000 kg梭鱸的內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖池，水溫20～25 ℃，pH 7.2，魚重200 g左右，魚發(fā)病率高達(dá)30%以上，日死亡50～100條，至取樣時死亡持續(xù)期已延續(xù)10日以上。病魚的主要癥狀為雙眼凸出且虹膜充血，體表正常，剖檢可見脾臟腫大，肝臟、腸、腎等器官未見異常，腹內(nèi)無積水，無異味。通過光學(xué)顯微鏡觀察排除真菌及寄生蟲感染。

自1976年P(guān)ier等[2]第一次從魚體上分離到致病鏈球菌，至今致病性無乳鏈球菌在水生動物宿主中被廣泛發(fā)現(xiàn)，主要分布于溫帶和亞熱帶養(yǎng)殖的魚類中，南美洲、亞洲、大洋洲等許多國家均有報道[3-7]，感染魚類包括羅非魚(Oreochromisspp)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、真鯛(Pagrosomusmajor)等多種水生動物[8-13]。自2007年以來，中國南方地區(qū)陸續(xù)有羅非魚無乳鏈球菌病暴發(fā)的報道，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。

本研究利用從瀕死梭鱸體內(nèi)分離得到的優(yōu)勢菌株對健康梭鱸進(jìn)行人工回歸感染，確定其致病性，通過形態(tài)觀察、溶血測定、生理生化特性測定以及結(jié)合生物學(xué)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等方法對病原菌進(jìn)行分類鑒定，同時進(jìn)行了耐藥性分析實(shí)驗(yàn)，以期為梭鱸的病原研究及發(fā)病機(jī)理、防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

1.1.1 材料來源

梭鱸樣品于2017年3月取自佛山順德某工廠化養(yǎng)殖場，體長35～40 cm，質(zhì)量(250±10)g，患病梭鱸眼睛雙側(cè)明顯凸出，虹膜出血，體表正常，脾臟腫大，其他內(nèi)臟組織未見異常。

1.1.2 細(xì)菌分離

分別從患病梭鱸眼、肝臟、脾臟取材接種于血平板，28 ℃培養(yǎng)36～48 h，做細(xì)菌分離，所檢的5條病魚不同部位均分離到數(shù)量不同的優(yōu)勢生長單菌落，菌落特征呈半透明、乳白色，光滑圓形，單菌落0.5 mm左右，γ溶血，選取單菌落進(jìn)一步在血平板上劃線純化，直至獲得純的培養(yǎng)菌株，命名為SL170/株，轉(zhuǎn)接到加腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)瓊脂斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 回歸感染梭鱸、羅非魚實(shí)驗(yàn)

1.2.1 材料來源

健康梭鱸購自廣東佛山順德，規(guī)格為(200±10)g，實(shí)驗(yàn)魚均暫養(yǎng)于珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動物房內(nèi)，分離得到的純培養(yǎng)菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，離心收集菌體，用0.65%的無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，實(shí)驗(yàn)共分6組菌液梯度，4.5×108、4.5×107、4.5×106、4.5×105、4.5×104、0 CFU/mL。

1.2.2 注射感染

實(shí)驗(yàn)用魚選用暫養(yǎng)一周后的健康梭鱸胸鰭基部腹腔注射，每組梯度菌液注射梭鱸10尾，每尾注射0.2 mL，各組實(shí)驗(yàn)魚均分別隔離養(yǎng)殖于實(shí)驗(yàn)魚池內(nèi)，養(yǎng)殖環(huán)境溫度為25～28 ℃，每隔4 h觀察一次，并記錄感染后的發(fā)病及死亡情況。對發(fā)病的梭鱸進(jìn)行細(xì)菌再分離培養(yǎng)，以能夠引起梭鱸發(fā)病死亡并能重新分離到原感染菌作為分離致病菌的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)菌的形態(tài)觀察及生理生化特性

將分離得到的純培養(yǎng)菌進(jìn)行涂片革蘭氏染色，并鏡檢，同時純培養(yǎng)菌株分別劃線接種于LB、HBI、5%新生牛血清+HBI、血平板上等培養(yǎng)基，置28 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h，觀察生長情況；參照盧邁新等[14]的鑒定方法采用法國梅里埃自動生化鑒定儀及API 32 STEP快速自動生化鑒定條及其他微生物微量生化鑒定管進(jìn)行細(xì)菌生理生化特性的測定，并根據(jù)測定結(jié)果對致病菌的種屬進(jìn)行判定。

1.4 細(xì)菌的分子鑒定

菌株經(jīng)BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，5 000 r/min離心10 min，收集菌體，按Bacterial DNA Extraction Kit說明書提取細(xì)菌基因組DNA，以細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列為：

上游引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，

下游引物R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性3 min；然后94 ℃下變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系為：天根2×Taq PCRMastermix 25 μL，10 μmol/L濃度上游引物F 1 μL，10 μmol/L濃度下游引物R 1 μL，ddH2O 22 μL，DNA模板1 μL，總體系為50 μL，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測后送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將分離菌的所測16S rRNA序列通過NCBI中的Blast工具進(jìn)行序列比對及同源性分析，并從中選取同源性較高的序列，利用Cluster X5.0分析序列的同源性并利用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 分離菌株的血清型及MLST分型測定

病原菌的分子血清型檢測參考Poyart等[15]方法，采用特異性分型引物，以分離菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物后進(jìn)行測序分析，根據(jù)測序結(jié)果通過NCBI中的Blast工具進(jìn)行序列比對，獲得分離菌株的血清型。

分離菌株的多位點(diǎn)序列分型(MLST)參考Jones等[16]方法，分別對adhP、pheS、atr、glnA、sdn、glcK、tkt七個基因特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長度為459～519 bp，擴(kuò)增引物均引自MLST分型網(wǎng)站http://pubmlst.org/，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測序，然后將相應(yīng)序列上傳網(wǎng)站得到唯一等位基因數(shù)值序列，再將該數(shù)值序列上傳致網(wǎng)站，獲得分離菌株的ST序列分型。

1.6 病原菌的耐藥性實(shí)驗(yàn)

采用常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散(紙片)法對經(jīng)過鑒定的菌株進(jìn)行30種常用抗生素的耐藥性檢測。藥敏片購自杭州天和微生物有限公司，于28 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h后進(jìn)行觀察，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)抑菌圈的大小對病原菌的耐藥性進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 病原菌形態(tài)觀察及培養(yǎng)特性

血平板上，病原菌菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，中央隆起狀，半透明，微呈乳白色，γ溶血，培養(yǎng)36～48 h菌落直徑多在1 mm以內(nèi)。 BHI培養(yǎng)基上，病原菌菌落為圓形，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，半透明，培養(yǎng)36～48 h菌落直徑1 mm左右。革蘭氏染色顯示，被檢細(xì)菌為革蘭氏陽性，球狀，多以鏈狀形式存在。在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)36～48 h不生長，在BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)36～48 h可見渾濁。

2.2 對健康梭鱸的致病性及病原重分離

健康梭鱸人工感染分離菌株后，梭鱸感染不同濃度梯度的菌液發(fā)病及死亡程度不同， 4.5×108、4.5×107、4.5×106CFU/mL均出現(xiàn)急性死亡，2 d后就出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，4 d內(nèi)接近100%死亡；4.5×105、4.5×104CFU/mL濃度死亡率明顯降低，全部實(shí)驗(yàn)魚7 d后基本可穩(wěn)定，未再發(fā)生死亡現(xiàn)象；對照組梭鱸在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)均健康存活，未見異常。感染死亡狀況見表1。死亡梭鱸均可復(fù)制出自然發(fā)病癥狀，取死亡梭鱸進(jìn)行病原分離，革蘭氏染色鏡檢，并做生理生化特性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的感染菌在外部形態(tài)、生理生化特性與初始分離得到的感染菌完全一致。

表1 分離菌株梭鱸感染結(jié)果Tab.1 Artificial infection results of the isolated strains

2.3 病原菌生理生化特性

分離菌株ID32 Strep檢驗(yàn)結(jié)果與常見的β溶血無乳鏈球菌有5項(xiàng)不同或有疑問，根據(jù)生化鑒定結(jié)果及機(jī)器判讀，所分離到的菌株初步判定為無乳鏈球菌Steptococcusagalactiae(表2)。核糖發(fā)酵等部分結(jié)果與張德峰等[17]和Evans等[18]已報道的γ溶血無乳鏈球菌生化鑒定結(jié)果也存在差異，因此該菌株的種屬鑒定還需要利用分子生物學(xué)的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 ID 32 Strep 生理生化鑒定結(jié)果Tab.2 Physiological and biochemical identification results for isolated strains by ID 32 Strep

注：+：陽性，-：陰性，-/+：結(jié)果不確定。

2.4 16S rRNA基因同源性分析

分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增16S rRNA基因得到一長度為1 500 bp的核酸序列，與預(yù)期目的條帶大小一致，將所得核酸片段進(jìn)行測序后，將所得序列通過NCBI上BLAST工具進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示，分離菌株與無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae的16S rRNA基因高度同源，同源性達(dá)99%～100%，與停乳鏈球菌S.dysgalactiae同源性96%～98%，與海豚鏈球菌S.iniae的同源性為96%～98%，所測序列與GenBank中已知已登錄的其他鏈球菌16S rRNA同源序列進(jìn)行匹配，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，結(jié)果表明分離菌株SL1701序列與無乳鏈球菌聚為一枝，其他海豚鏈球菌S.iniae、停乳鏈球菌S.dysgalactiae等各聚為一枝。

圖1 根據(jù)無乳鏈球菌等的16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S r RNA gene of S.agalactia and other bacterial strains

2.5 分離菌株的分子血清型及MLST分型

按照Poyart等[15]方法，分離菌株基因組DNA利用Ib引物擴(kuò)增出了一條770 bp左右大小條帶，表明SL1701菌株分子血清型為Ib型。

表3 分離菌株藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The antibiotic sensitivity test of the isolates

注：S：敏感，I：中度敏感，R：耐藥。

分離菌株SL1701的7個管家基因測序結(jié)果MLST分析表明，adhP、pheS、atr、glnA、sdnA、glcK、tkt 7個等位基因的等位基因類型的賦值分別為54、17、31、4、26、25、19，根據(jù)此數(shù)值序列得到的分離菌株MLST分型為ST261型。

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)

用30種抗生素對致病菌株進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明：分離菌株對供試的氟苯尼考、氟羅沙星、磺胺異惡唑等17種藥物敏感，對強(qiáng)力霉素、阿奇霉素等5種藥物中度敏感，對氨芐青霉素、四環(huán)素、復(fù)達(dá)欣等8種藥物不敏感(表3)。

3 討論

本研究是我國發(fā)現(xiàn)并報道的第一例梭鱸細(xì)菌性病害，也是我國第一例無乳鏈球菌感染冷水魚類的報道。在我國南方無乳鏈球菌感染多發(fā)生在羅非魚，大多數(shù)發(fā)病羅非魚類表現(xiàn)癥狀為游動異常，單側(cè)或雙側(cè)眼球突出，角膜發(fā)白渾濁虹膜充血，體表不同程度充血、出血，剖檢后腹內(nèi)多有黃色腹水，膽囊腫大，腦膜充血等癥狀[19]。而本次分離得到的病原菌僅表現(xiàn)出眼球凸出，虹膜充血，脾臟腫大的癥狀，未見其他體表及內(nèi)臟異常，發(fā)病梭鱸只是游動緩慢，未發(fā)現(xiàn)狂游、打轉(zhuǎn)等異?，F(xiàn)象。之所以與羅非魚癥狀不同可能是以下兩個方面的原因：一是發(fā)病魚池最高水溫在25 ℃左右，羅非魚一般在30 ℃以上才會出現(xiàn)大面積發(fā)病感染，25 ℃以下羅非魚養(yǎng)殖鮮有無乳鏈球菌感染發(fā)病的報道，溫度是無乳鏈球菌致病能力的一個重要因素，劉志剛等[7]研究表明，溫度在25～37 ℃時，無乳鏈球菌的生長速度、粘附能力、入侵和轉(zhuǎn)運(yùn)能力、致病能力均與溫度呈正相關(guān)，37 ℃為無乳鏈球菌最適生長溫度，因此在相對低溫環(huán)境下發(fā)病機(jī)制可能也有所不同。二是不同血清型無乳鏈球菌致病機(jī)制可能也不完全相同，我國南方羅非魚無乳鏈球菌感染主要集中于Ia血清型，僅有少數(shù)Ib型感染報道。

本研究所分離病原菌溶血活性測定結(jié)果為γ溶血，而國內(nèi)所分離無乳鏈球菌絕大多數(shù)為β溶血[20-22]，目前國內(nèi)僅有3次報道γ溶血型無乳鏈球菌[15，23-24]，本研究所分離的菌株SL1701血清型為Ib-ST271，與張德峰等[17]分離得到的無乳鏈球菌WT1451血清型相同，但WT1451株為強(qiáng)致病性毒株，致病菌的濃度為4.5×103CFU/mL 時，死亡率為85%，而SL1701菌株的濃度為4.5×104CFU/mL 時，死亡率僅為20%，毒力明顯低于張德峰等研究結(jié)果，這可能由于回歸感染實(shí)驗(yàn)溫度不同所致。本研究生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果與β溶血無乳鏈球菌具有一定差異，主要表現(xiàn)為核糖、海藻糖、VP實(shí)驗(yàn)等生化項(xiàng)目呈陰性，而β溶血無乳鏈球菌這些項(xiàng)目均呈陽性，但與張德峰、黎婭等[17，23]研究結(jié)果相比除VP項(xiàng)目外，其他生化項(xiàng)目均相符，本研究病原VP反應(yīng)陰性，張德峰等結(jié)果為陽性，黎婭等結(jié)果為陰性，這也再次證明了γ溶血與β溶血的無乳鏈球菌具有不同的生化反應(yīng)譜。Rosinski-Chupin等[25]研究表明γ溶血型無乳鏈球菌的碳源運(yùn)輸系統(tǒng)和降解多糖相關(guān)酶等基因出現(xiàn)缺失或失活，導(dǎo)致其喪失不同碳源的利用能力，這一定程度上也解釋了為何γ溶血無乳鏈球菌生理生化實(shí)驗(yàn)中過多碳源反應(yīng)為陰性的原因。

目前，當(dāng)細(xì)菌性疾病暴發(fā)時，化藥經(jīng)常是重要治療手段，但由于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量化藥的使用，造成了病原菌出現(xiàn)不同程度的耐藥性，本研究所分離無乳鏈球菌因?yàn)棣萌苎瑖鴥?nèi)鮮有報道該類型菌株的耐藥實(shí)驗(yàn)，本研究分離菌株與國內(nèi)分離的β溶血鏈球菌相比，耐藥性具有一定的差異，如2008年張新燕等[13]從廣東分離的無乳鏈球菌及2012年周清等[26]從海南分離的無乳鏈球菌均對青霉素敏感，而本研究所分離病原對青霉素極度耐受，不形成任何抑菌圈；霍歡歡等[27]對2010—2011年從海南省各地分離的24株菌株進(jìn)行耐藥性研究，結(jié)果表明所分離無乳鏈球菌對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、新霉素等)敏感性不高，但本研究病原菌對這些藥物較為敏感。之所以出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能跟菌種差異和菌株地域來源不同有關(guān)。在實(shí)際用藥時應(yīng)結(jié)合耐藥實(shí)驗(yàn)，針對性的施用有效藥物，用于治療及預(yù)防該細(xì)菌性疾病的發(fā)生，同時應(yīng)避免濫用、過量施用魚藥，導(dǎo)致加速微生物耐藥變異、藥物殘留等副作用的發(fā)生。

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