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    甲醛致小鼠急性炎性疼痛時(shí)脊髓溴結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白4的表達(dá)上調(diào)

    2018-05-16 05:27:19朱又椰曾佳玉曹文宇劉政海
    關(guān)鍵詞:后角美辛吲哚

    朱又椰,楊 惠,曾佳玉,曹文宇,劉政海,萬(wàn) 煒,何 潔*

    (南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤研究所; 腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.解剖學(xué)教研室, 湖南 衡陽(yáng) 421001)

    溴結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)是染色質(zhì)“閱讀者”,能夠與組蛋白上的乙酰化賴氨酸殘基相結(jié)合,從而調(diào)控基因的表達(dá)[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)BRD4在腦內(nèi)廣泛表達(dá),可以通過(guò)識(shí)別即早基因及突觸相關(guān)蛋白的乙?;稽c(diǎn),影響基因轉(zhuǎn)錄,參與學(xué)習(xí)記憶的形成[2],組蛋白乙?;c炎性疼痛也有關(guān)系[3]。但是BRD4在脊髓中的表達(dá)及其在疼痛中作用鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究首先檢測(cè)BRD4在小鼠脊髓后角中的細(xì)胞定位,然后通過(guò)建立甲醛疼痛模型,探討B(tài)RD4在炎性疼痛中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF二級(jí)雌性昆明小鼠,體質(zhì)量25~30 g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào):SYXK(湘)2015-0001]。

    1.1.2 主要試劑:兔來(lái)源BRD4單克隆抗體和小鼠來(lái)源(NeuN)單克隆抗體(Abcam公司);甲醛溶液(WellBiosciece公司);吲哚美辛(大連美侖生物公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組及處理:將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control組)、甲醛組(FM組)和甲醛+吲哚美辛組(FM+Indo組),每組12只。FM組:小鼠予以右側(cè)后肢足底皮下注射25 μL 1%甲醛溶液;FM+Indo組:小鼠腹腔注射吲哚美辛(20 mg/kg)1 h后注射甲醛溶液。

    1.2.2 疼痛行為學(xué)評(píng)分:注射1%甲醛溶液后,即刻放入有機(jī)玻璃箱內(nèi),同時(shí)用攝像機(jī)觀察60 min小鼠舔咬右側(cè)后足的疼痛行為,并記錄每5 min內(nèi)動(dòng)物舔咬右后足行為的持續(xù)時(shí)間,其持續(xù)時(shí)間與小鼠疼痛嚴(yán)重程度成正比[4]。

    1.2.3 免疫組化檢測(cè)脊髓BRD4的表達(dá):4%多聚甲醛灌注固定后取出脊髓腰骶膨大段(L4-L6),固定24 h后梯度沉積,然后冰凍切片。3%的H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,5%羊血清封閉,加一抗(anti-BRD4,1∶1 000,) 4 ℃過(guò)夜;加生物素化山羊抗兔IgG二抗(1∶200)中室溫孵育2 h,加AB液(ABC kit,1∶200,Vector),DAB顯色、晾干、脫水、透明和封片。最后在EVOS FL Auto顯微鏡下觀察并拍攝,計(jì)算BRD4免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

    1.2.4 免疫熒光檢測(cè)BRD4與NeuN的定位情況:選取對(duì)照組小鼠的脊髓切片4 ℃、5%驢血清封閉過(guò)夜,將兔來(lái)源BRD4單抗(1∶400)分別加入鼠來(lái)源NenN單抗(1∶500)、鼠來(lái)源GFAP單抗(1∶1 000)和鼠來(lái)源單抗Iba-1(1∶400)混合液中4 ℃ 孵育過(guò)夜; Alexa 488標(biāo)記的驢抗兔(1∶500)和Alexa 594標(biāo)記的驢抗鼠(1∶500)的混合液室溫避光孵育2 h;封片,置于顯微鏡下觀察并拍照。

    1.2.5 Western blot檢測(cè)BRD4的表達(dá):取小鼠脊髓腰骶膨大段,加入200 μL組織蛋白抽提液,取上清液,用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉后,加特異性抗BRD4抗體(1∶200)和抗Tublin抗體(1∶2 000),4 ℃孵育過(guò)夜;PBS-T 漂洗 10 min×3次,特異性二抗室溫孵育2 h;用PBS-T漂洗10 min×3次后在ECL成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影成像。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 BRD4在小鼠脊髓中的表達(dá)及細(xì)胞定位

    BRD4主要分布于小鼠脊髓后角淺層(板層Ⅰ~Ⅱ)區(qū)域,定位于神經(jīng)元(圖1)。結(jié)果顯示:BRD4主要表達(dá)在NeuN陽(yáng)性神經(jīng)之中,BRD4與NeuN存在廣泛的共表達(dá)。

    2.2 BRD4在甲醛疼痛模型小鼠脊髓中的表達(dá)變化

    與對(duì)照組相比,甲醛組小鼠表現(xiàn)出明顯的雙相痛行為,其中第Ⅰ相痛出現(xiàn)在注射后0~5 min,第Ⅱ相痛出現(xiàn)在注射后10~40 min(圖2A)。與對(duì)照組相比,甲醛組雙側(cè)脊髓后角淺層(板層Ⅰ~Ⅱ)BRD4表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2B)。

    2.3 吲哚美辛預(yù)處理對(duì)甲醛疼痛模型小鼠脊髓中BRD4的表達(dá)影響

    吲哚美辛預(yù)處理可減輕甲醛誘導(dǎo)的第二相疼痛,并下調(diào)小鼠雙側(cè)脊髓BRD4的表達(dá)。與甲醛組相比,吲哚美辛干預(yù)組能明顯減輕甲醛誘導(dǎo)的第二相疼痛(P<0.05)(圖3A)。同時(shí),顯著下調(diào)小鼠雙側(cè)脊髓BRD4表達(dá)(P<0.05) (圖3B)。

    圖1 免疫熒光觀察BRD4在小鼠脊髓中的定位Fig 1 Observe the localization of BRD4 in the spinal cord of mice by immunofluorescence

    A.licking time after injection of saline or formaldehyde for 1 hour; B.immunostaining of BRD4 in the left and right side of spinal cord horn;*P<0.05,**P<0.01 compared with the control group

    A.the licking time after injection of saline or FM within 1 hour in each group; B.the immunostaining of BRD4 in the left and right side of spinal cord horn; C.protein expression of BRD4 in the left and right side of spinal cord horn;*P<0.05 compared with the FM or control group;**P<0.01,***P<0.001 compared with the control group;****P<0.0001,#P< 0.05 compared with the FM group;△P< 0.05 compared with the FM group

    3 討論

    BRD4作為一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子,能夠結(jié)合乙?;慕M蛋白,在炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。組蛋白乙酰化與炎性疼痛又密切相關(guān),脊髓后角組蛋白去乙?;冈谕耆ナ献魟┱T導(dǎo)大鼠炎性痛模型中表達(dá)上調(diào),其抑制劑可通過(guò)調(diào)控谷氨酸2受體,氨基丁酸的表達(dá),從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6]。脊髓是疼痛調(diào)節(jié)中樞,脊髓后角主要為與傳導(dǎo)感覺(jué)沖動(dòng)有關(guān)的神經(jīng)元,其淺層在疼痛信息的傳遞過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能[7]。那么BRD4在脊髓的表達(dá)情況如何,其與炎性痛的發(fā)生發(fā)展有什么關(guān)系呢?

    本研究采用免疫熒光方法檢測(cè)了小鼠脊髓BRD4與神經(jīng)元NeuN,星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1的共表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在脊髓后角淺層(板層Ⅰ~Ⅱ)中BRD4與NeuN存在明顯的共定位現(xiàn)象, 而與GFAP和Iba-1共定位表達(dá)較少。BRD4在成年小鼠全腦中均有表達(dá),而且在皮質(zhì)和海馬中,BRD4與神經(jīng)元的標(biāo)志物NeuN有明顯的共表達(dá),但是與膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有共定位,進(jìn)一步,作者還分離培養(yǎng)了皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中BRD4 mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯高于膠質(zhì)細(xì)胞,以上結(jié)果提示BRD4主要表達(dá)在神經(jīng)元中,這與我們的研究結(jié)果一致。BRD4通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元即早基因及突觸相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶[2]。提示我們,脊髓后角淺層(板層Ⅰ~Ⅱ)BRD4的表達(dá),可能通過(guò)作用于該部位神經(jīng)元,參與炎性痛的調(diào)節(jié)。

    甲醛疼痛模型是經(jīng)典的炎性痛模型,甲醛注射后小鼠出現(xiàn)典型的雙相疼痛。第二相痛與炎性反應(yīng)激活有關(guān)[4]。行為學(xué)結(jié)果表明我們成功復(fù)制了小鼠甲醛炎性痛模型。并且檢測(cè)到甲醛組小鼠雙側(cè)脊髓后角中BRD4的表達(dá)顯著高于對(duì)照組小鼠。提示BRD4表達(dá)與甲醛疼痛關(guān)系密切,機(jī)制可能與炎性反應(yīng)激活有關(guān)。右側(cè)足底注射會(huì)導(dǎo)致左側(cè)脊髓BRD4的表達(dá)變化的原因是左側(cè)和右側(cè)脊髓之間接收到的信號(hào)強(qiáng)度不一致[8]。

    吲哚美辛是一種非甾體類抗炎藥物,可以通過(guò)促進(jìn)脊髓內(nèi)五羥色胺的釋放發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[9-10]。本研究通過(guò)吲哚美辛治療緩解了甲醛誘導(dǎo)的第二相疼痛,證實(shí)了吲哚美辛可治療甲醛所致的炎性痛。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果表明,吲哚美辛治療組小鼠脊髓后角BRD4的表達(dá)顯著弱于甲醛組。進(jìn)一步提示了BRD4表達(dá)參與了甲醛炎性疼痛。其機(jī)制可能是吲哚美辛通過(guò)抑制NF-κB 的激活從而抑制炎性反應(yīng),而NF-κB的活性是BRD4能夠識(shí)別乙?;腞el A發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的重要因素[11-12]。

    本研究基本確定,BRD4在小鼠脊髓后角淺層(板層Ⅰ~Ⅱ)主要定位于神經(jīng)元,在急性炎性疼痛中發(fā)揮重要作用。然而,BRD4的表達(dá)與脊髓后角炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未完全闡明,有待進(jìn)一步研究。總之,BRD4與急性炎性疼痛關(guān)系密切,有望成為鎮(zhèn)痛藥物的新靶點(diǎn)。

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