微生物顆粒復合肥的研制與特性研究

何鵬搏,胡 洲,崔文艷,何月秋,吳毅歆,Mark Dondi M. Arboleda

(1.云南農(nóng)業(yè)大學,云南 昆明 650201;2. School of Environmental Sciences and Management, University of the Philippines Los Baos, Los Baos, Laguna 4031, Philippines)

肥料是農(nóng)作物生長和增產(chǎn)的物質基礎。由于我國人口眾多,人均可耕地面積較小,所以農(nóng)產(chǎn)品總量的增加依賴于化學肥料的投入。從20世紀80年代到21世紀初,化肥對我國糧食產(chǎn)量的實際貢獻率高達58.91%,但我國已成為世界上化肥生產(chǎn)和施用的第一大國,氮肥、磷肥、鉀肥的消費量分別占世界的31.2%、29.6%、18.8%[1-2]。然而,過量施用化肥會降低農(nóng)產(chǎn)品的品質,增加生產(chǎn)成本，破壞土壤結構，加劇面源污染,不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。為了降低過量投入化肥對環(huán)境的負面影響,2015年3月農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《到2020年化肥使用量零增長行動方案》,以期到2020年實現(xiàn)主要農(nóng)作物化肥使用量零增長[3]。

我國磷礦資源儲量居世界第一,但中低品位磷礦占儲量的85%以上,其中含磷15%以下的占28.02%,且中低品位磷礦以沉積型磷塊巖(膠磷礦)難選磷礦為主,后者中有用礦物顆粒細,與其他巖石結合緊密,不易分離,只有將磷礦磨細到200目時才能夠解離出大部分單體,其中混合型磷礦選礦難度更大,因此我國中低品位磷礦是世界上最難被利用的磷礦石之一[4]。將磷礦石磨成粉后直接用作磷肥施用,其加工簡單,可直接使用中低品位磷礦資源[5],但供磷強度小、容量大、后效長,當季肥效不明顯。土壤微生物是溶磷、解鉀最為活躍的要素。補充土壤有益微生物,施用微生物肥料是提高土壤肥力的重要手段之一,也是減少化學肥料施用量的研究熱點。本文鑒于解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensB9601-Y2(以下簡稱Y2)易在逆境中形成芽孢,耐鹽性好,促生長效果明顯,及膠質類芽孢桿菌K3 (Paenibacillusmucilaginosus,以下簡稱K3)的解鉀特點,利用這兩個益生菌研制出顆粒微生物復混肥,測定了其肥效功能與特性,以期為該類微生物復混肥的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 益生菌株

Y2和K3均為實驗室保存菌株,前者為解磷菌,后者為解鉀菌。兩種菌株在用于田間試驗時為野生型,用于盆栽試驗時為利福平(120 μg/mL)抗性菌株。Y2以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng), K3以硅酸鹽細菌培養(yǎng)基(蔗糖5.0 g, Na2HPO42.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, CaCO30.1 g, FeCl3· 6H2O 5.0 mg,瓊脂18.0～20.0 g, pH 7.5～8.5,蒸餾水1 L)培養(yǎng)。

1.2 解磷、解鉀菌促肥效測定

將油菜品種“文油1號”種植在云南農(nóng)業(yè)大學后山農(nóng)場,將玉米品種“點谷1號”種植在云南省硯山縣農(nóng)業(yè)科技示范園。共設置10個處理:清水、LB培養(yǎng)液、磷礦粉(P)、解磷菌(Y2)、解鉀菌(K3)、Y2+磷礦粉、K3 +磷礦粉、Y2+ K3復合菌、Y2+K3+磷礦粉、過磷酸鈣。每塘用固形物10 g,或者固形物10 g加105CFU/mL濃度的菌劑10 mL,或10 mL的105CFU/mL菌劑或LB培養(yǎng)液。每個處理重復3次，小區(qū)面積66.7 m2。油菜的行距×株距為40 cm×30 cm;玉米的行距×株距為(80 cm+40 cm)×25 cm。在整個生長期間未施用任何化學肥料。玉米出苗20 d后,各小區(qū)隨機調查20株的葉片數(shù)和型高(基部到最長葉片的距離);油菜出苗30 d后,各小區(qū)5點調查10株油菜的根長、型高和鮮重。

1.3 含磷復合肥的研制

80目、含磷20%的磷礦粉來自云南省華寧縣。兩種菌劑的質量各占5%,即最終有效菌量為5×106CFU/g；基質中磷礦粉20%、尿素50%、崩解劑碳酸鈣10%、粘結劑羧甲基淀粉鈉10%；將各組分混合后，加入適量的清水，并混勻,以不能捏成團為限；最后將其倒入圓盤造粒機(BWD0-59-0)中造粒,根據(jù)顆粒成形的狀況添加適量清水,在50 ℃左右的烘箱中烘干,制成顆粒復合肥(含水量5%,篩分顆粒約0.3 cm)，備用,下文稱微生物顆粒復合肥。無菌顆粒肥的制備以尿素代替菌劑,其他組分與微生物顆粒復合肥相同。

1.4 微生物磷鉀肥的功能測定

盆栽試驗共設不施肥對照(CK)、磷礦粉、混合菌液、無菌顆粒肥、微生物顆粒復合肥(含菌量105CFU/g)5個處理。將磷礦粉、無菌顆粒肥、微生物顆粒復合肥各10 g,混合菌液100 mL(5×105CFU/g)分別施入裝有500 g紅壤土的塑料盆,重復3次,各處理均不額外施肥。將玉米品種“會單4號”的種子用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min后,在流水中沖洗至無漂白粉味,再用去離子水沖洗5遍后播種。每盆播6粒,1周后間苗,每盆留4株。依土壤濕潤狀況,進行定量澆水管理。

40 d后,從盆中小心地拔出整株玉米,抖掉粘在根上的大部分土壤后,在流水中洗凈擦干,平鋪在桌面上,從莖基部向上測量玉米型高,向下測量玉米根長，再記錄整株玉米的葉片數(shù)；待清洗后的玉米植株無液態(tài)水后測量鮮重,爾后將植株烘至衡重,秤量干重。

1.5 顆粒復合肥中菌株間生物拮抗關系

將研制成功的顆粒復合肥于室溫下密封保存,1個月后取樣調查。取1 g顆粒復合肥溶于99 mL無菌水中,依次稀釋成105、106倍液。再從其中移取0.1 mL菌液，分別接種到含有120 μg/mL利福平的LB固體培養(yǎng)基和硅酸鹽細菌培養(yǎng)基上,用涂布器涂勻,重復3次,在30 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h,檢測其中的菌落數(shù)量。

1.6 顆粒復合肥中菌體在土壤中的動態(tài)變化

待溫室玉米苗生長至10 cm左右高時,施入10 g顆粒復合肥,與土壤混合,并分別于7、15、25、33、42和49 d后采集土壤樣品,在加入利福平(120 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基和硅酸鹽細菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別計數(shù)土壤中的溶磷菌和解鉀菌的含量。

1.7 溫度和水分對顆粒菌劑崩解性的影響

將顆粒復合肥與不同含水量的土壤混合,并用塑料膜覆蓋以防失水,每隔4 h觀察1次。共設置10%、15%、20%、25%等4個含水量，并在恒溫培養(yǎng)箱中設置10、20、30 ℃等3個溫度梯度。采用土壤水分速測儀(TZS-1)檢測含水量,將不銹鋼探針完全埋于土壤之中,每個土樣重復檢測3次,取其平均值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

對所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 7.0進行方差分析和Ducan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 益生菌株的肥效作用

從大田試驗結果來看,所有處理在出苗后20 d內對玉米均有肥效作用,但LB培養(yǎng)液和磷礦粉處理的玉米葉片數(shù)和型高與清水空白對照無顯著差異；所有益生菌處理對玉米均有顯著的肥效作用,葉片數(shù)增加46.42%～72.98%,型高增加71.74%～100.17%,其中磷礦粉與兩株益生菌共同作用,其促進玉米生長的效果優(yōu)于過磷酸鈣,葉片數(shù)和型高比過磷酸鈣處理分別高7.00%和9.04%,且比(Y2+K3)菌液處理的玉米葉片數(shù)增加4.32%,型高增高8.63%。但從加入了磷礦粉與未加磷礦粉的成對數(shù)據(jù)來看,促生長的效果主要來源于益生菌(表1)。

從40 d苗齡的油菜長勢來看,LB培養(yǎng)液和磷礦粉都對油菜生長有一定的肥效作用,但未達顯著水平。所用益生菌處理均對油菜有顯著的促生長效果,其中Y2+磷礦粉處理的油菜根長顯著地長于Y2菌液處理的,其根長較空白對照增加了12.54%,比Y2菌液處理增加了2.45%；此外，Y2+磷礦粉處理的油菜型高和鮮重分別比空白對照增加了27.13%和48.23%,但與Y2菌液處理差異不顯著。K3菌液無解磷效果,它單獨使用與加了磷礦粉一起使用,對玉米的肥效作用無顯著差異,根長、型高和鮮重基本一致。(Y2+K3)菌液處理以及磷礦粉+(Y2+K3)菌液處理對油菜都有很好的肥效作用,但后者僅在型高上顯著地高于前者,高出7.10 cm,增加率達18.84%。磷礦粉+(Y2+K3)菌液處理促進油菜生長的效果與施用過磷酸鈣相當,其根長、型高和鮮重分別較空白對照增加了16.42%、55.97%和57.76%，較(Y2+K3)菌液處理分別增加了3.19%、18.84%和2.19%(表2)。

表1 益生菌劑對玉米的促生長效果

注:同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達5%顯著水平,下同。

表2 益生菌劑對油菜苗期的促生長效果

2.2 顆粒復合肥的肥效作用

從盆栽試驗結果(表3)來看:磷礦粉處理玉米的根長、型高和鮮重與清水對照沒有顯著差異;菌液組(105CFU/mL的Y2+K3發(fā)酵液)、無菌肥組和微生物顆粒復合肥組(包含105CFU/g Y2+K3)玉米的根長、型高和鮮重均與清水對照存在顯著差異；無菌肥組和菌液組在根長、型高和鮮重方面沒有顯著差異;微生物顆粒復合肥組與無菌肥組相比,在根長、型高和鮮重方面差異顯著。因此,微生物顆粒復合肥中的菌群對玉米植株具有很好的促生效果,與CK組相比,其根長、型高和鮮重的增加率分別達到35.90%、36.82%和63.93%,分別高出無菌肥組14.20%、10.10%和14.28%。由于無菌顆粒肥組的尿素用量高于微生物顆粒復合肥5%,所以微生物顆粒復合肥在減少化學肥料用量5%的情況下,仍能提高肥效10%以上。

2.3 顆粒微生物復合肥料的特性

2.3.1 顆粒微生物復合肥中菌株間生物拮抗關系 以LB和硅酸鹽細菌培養(yǎng)基分別檢測解磷菌Y2和解鉀菌K3在顆粒微生物復合肥中的菌量,結果(表4)表明,隨著時間的推進,菌株數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在第23天時達到最大值。具體來說，菌株數(shù)量從第7天至第23天呈上升趨勢,而從第23天至第31天菌株數(shù)量略有下降,即Y2的有效活菌數(shù)從2.77×106CFU/g上升到4.57×106CFU/g，再下降到3.77×106CFU/g, K3的有效活菌數(shù)從2.30×106CFU/g上升到2.93×106CFU/g,再下降到2.53×106CFU/g。但兩種益生菌的有效活菌數(shù)變化未達到數(shù)量級水平,且兩者間無明顯的拮抗作用。

表3 微生物顆粒復合肥對玉米幼苗的促生長效果

表4 顆粒微生物復合肥中Y2和K3的菌量 ×105 CFU/g

2.3.2 顆粒微生物復合肥中菌株在土壤中的定殖能力 在溫室盆栽試驗中,待玉米苗斷乳后,施入顆粒微生物復合肥,分別在施入后7、15、25、33、42、49 d,取各處理的土壤,在利福平(120 μg/mL)平板培養(yǎng)基上檢測菌落量。結果表明,Y2和K3兩個菌株的數(shù)量都呈現(xiàn)先下降再上升,最后逐漸下降的趨勢(表5)，其中K3菌株的下降幅度比Y2大,這可能與菌株對逆境的耐受性不同有關。具體而言，最初施入土壤中的菌肥Y2和K3含量都為7.00×106CFU/g；到第15天時,菌體數(shù)量有所下降,土壤中K3數(shù)量為4.67×106CFU/g, Y2為4.93×106CFU/g；在第33天，土壤中K3數(shù)量回升至6.00×106CFU/g,Y2回升至6.30×106CFU/g,與第49天時的菌量無顯著差異。但從總體菌量來看,兩個菌株的變化量均不大,未達到數(shù)量級變化水平。

表5 Y2和K3菌株在土壤中的數(shù)量變化 ×106 CFU/g

2.3.3 溫度和水分對顆粒菌肥崩解的影響 從表6可以看出：溫度和水分對顆粒菌肥的崩解有非常大的影響；顆粒復合肥在溫度和水分都較低時,崩解緩慢；當土壤水分含量不變時,提高土壤溫度會加快顆粒復合肥的崩解速度,且土壤水分含量即使很低(低于10%),顆粒復合肥在30 ℃下也能很快崩解；當土壤溫度不變時,提高土壤水分含量也會加快顆粒復合肥的崩解速度。綜上所述,在土壤溫度10 ℃以上、土壤含水量15%以上條件下,顆粒復合肥在3 d內都能崩解。因此，這是一個適合農(nóng)水生和旱地作物的顆粒菌肥。

3 討論

益生菌B9601-Y2是1株具有溶磷、固氮和解鉀能力的優(yōu)良菌株,它具有促進眾多農(nóng)作物生長和增產(chǎn)的效果[6-10]； K3是1株能解鉀和促生長的菌株[11],它們在磷礦粉和鉀長石液體培養(yǎng)中具有很好的溶磷和解鉀作用[12]。本試驗結果表明：這兩種益生菌株對玉米和油菜均具有顯著的促生長效果；80目的磷礦粉本身不能被玉米和油菜植株根系很好地利用，因此當這兩種菌株與磷礦粉一起施用時,其促進玉米生長的效果與兩種菌株一起施用的效果差異不顯著，但其提高油菜型高的效果顯著優(yōu)于這兩種菌株一起施用的效果；此外，與單獨施用益生菌液Y2相比，Y2與磷礦粉同時施用顯著地促進了油菜根系生長。說明Y2可能具有一定的溶解磷礦粉的能力，從而它與磷礦粉一起施用時能促進油菜的根系和型高生長。

當將Y2和K3菌株與尿素、磷礦粉做成顆粒復合肥時,其肥效顯著地(P<0.05)優(yōu)于不用這兩個菌株的尿素與磷礦粉處理,比無菌的顆粒肥少用5%的尿素,而施用后玉米根長、型高和鮮重分別增加了14.20%、10.10%和14.28%。鑒于磷礦粉單獨使用的肥效不明顯以及兩個菌株與尿素、磷礦粉復合效果顯著,證明將溶磷解鉀菌株與磷礦粉及無機氮結合,做成新型的顆粒復合肥,用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是可行的。它既可以充分利用低品位磷礦石,節(jié)約資源,減少浪費,同時也可以減少開礦對江河湖泊的污染,還符合減肥增效的目標。盡管這兩種菌株在前期的肥效與施用化學肥料相當,但它們利用土壤中難溶磷、鉀的作用是有限的,因此要獲得足夠的作物產(chǎn)量,還要補充一定量的無機肥料,即微生物肥可以減少化學肥料的應用,但不能完全替代化學肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用。

表6 不同條件下顆粒復合肥完全崩解時間 h

微生物菌株的肥效除與其活性有關外,還與其在土壤中的定殖能力、在復合肥中的生存能力、多個功能菌株間的相容性等有關。本研究所用的兩個菌株在含水量5%的顆粒復合肥中,在室溫下貯藏31 d,施入紅壤土49 d后,其活菌數(shù)沒有本質性的下降,都達106CFU/g以上,且兩個菌株間無拮抗作用,與培養(yǎng)皿中對峙培養(yǎng)結果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)相同。表明這兩個菌株具有較好的商品性及在玉米田間的定殖能力。然而,這種顆粒微生物復混肥在其他土壤中的效果還有待進一步驗證。

雖然在國外有采用磷礦石和海綠石來替代化學肥料[13],或直接施用磷礦粉,借助植物根系分泌物的幫助提供植物生長所需的磷的報道[5,14],但是,目前未見到用低品位磷礦粉與尿素、益微菌株及粘結劑、崩解劑混合生產(chǎn)成顆粒微生物復合肥的產(chǎn)品問世。本研究采用這些成分,嘗試性地研制出了該類制品,在土壤溫度10 ℃以上、土壤含水量15%以上條件下,該顆粒微生物復合肥能夠在較短時間內崩解,且土壤含水量越高,土壤溫度越高，其崩解的速度越快,這有利于在很多旱地里施用,便于作物吸收。本次制品在運輸和耐壓方面還有待研究,但無論如何,這種制劑為肥料家族增加新類型提供了新的思路。

參考文獻:

[1] 孟遠奪,許發(fā)輝,楊帆,等.我國種植業(yè)化肥施用現(xiàn)狀與節(jié)肥潛力分析[J].磷肥與復肥,2015,30(9):1-4，13.

[2] 魏世轅,熊祥祖,王威,等.離子交換法除去濕法磷酸中鐵離子的研究[J].浙江化工,2010,41(1):25-27.

[3] 黃鐵平,吳遠帆,何寶生,等.湖南省農(nóng)作物化肥使用量零增長行動策略:基于礦質營養(yǎng)與有機營養(yǎng)并重使用的分析[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究,2016,37(5):885-891.

[4] 張海鵬,劉強,彭建偉,等.中低品位磷礦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用展望[J].南方農(nóng)業(yè)學報,2012,43(4):477-480.

[5] Saueia C H, Mazzilli B P, Fávaro D I T. Natural radioactivity in phosphate rock, phosphogysum and phosphorate fertilizer in Brazil [J]. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2005, 264(2): 445-448.

[6] 劉拴成,楊進成,馬麗華,等.解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2提高玉米生長和產(chǎn)量的效應[J].玉米科學,2010,18(6):28-32.

[7] 崔文艷,何朋杰,尚娟,等.解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2對玉米的防病促生長效果研究[J].玉米科學,2015,23(5):153-158.

[8] 程少麗,張俊祥,何月秋,等.生防菌株B9601-Y2對作物生長和產(chǎn)量的影響[J].長江蔬菜,2012(2):54-58.

[9] 吳興興,吳毅歆,趙正龍,等.4種PGPR菌株拌種對干旱條件下蠶豆生長及產(chǎn)量的影響[J].干旱區(qū)研究,2012,29(2):203-207.

[10] He P, Hao K, Blom J, et al. Genome sequence of the plant growth promoting strainBacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumB9601-Y2 and expression of mersacidin and other secondary metabolites [J]. Journal of Biotechnology, 2012, 164(2): 281-291.

[11] 胡洲,吳毅歆,毛自朝,等.硅酸鹽細菌的分離、鑒定及其生物學特性研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報,2013,35(3):609-614.

[12] 劉云華.溶磷菌Burkholderiacenocepacia篩選、應用及溶磷機理的初步研究[D].昆明：云南農(nóng)業(yè)大學,2014.

[13] 盛下放.硅酸鹽細菌NBT菌株在小麥根際定殖的初步研究[J].應用生態(tài)學報,2003,14(11):1914-1916.

[14] Castro L, Tourn S. Direct application of phosphate rocks and glauconite as alternative sources of fertilizer in Argentina [J]. Explor Mining Geol, 2003, 12: 71-78.