不同質地楊梅果實肉柱細微構造與細胞壁組分及相關酶活性分析

焦 云,柴春燕,馬煒煒,舒巧云

(1.浙江省寧波市農業(yè)科學研究院,浙江 寧波 315040;2.浙江省慈溪市林特技術推廣中心,浙江 慈溪 315300)

楊梅(MyricarubraSieb. and Zucc.)是原產于我國南方的特色果樹,果實富含花色素苷,具有較高的營養(yǎng)價值,鮮食與加工兼宜[1]。楊梅果實無外果皮包被,其可食用部分為果實外層細胞的囊狀突起,稱為“肉柱”,肉柱柔軟,易受機械損傷,采后果實品質劣變迅速,極不耐貯運。肉柱有長短、粗細、尖鈍、軟硬之分[2]。在一般情況下,若楊梅果實肉柱呈圓鈍形,則柔軟多汁,風味佳良;反之,若果實肉柱頭尖而硬,則結構致密,較耐貯運,但汁少且風味差[3]。另外,果實肉柱質地及形狀與品種遺傳特性關系密切。因此,探討楊梅果實硬度質地差異的內在決定因素,對果品品質調控及貯藏等具有重要的理論指導意義。

果實質地是水果品質構成因子中最重要的因素之一,而植物細胞壁使果實具有一定的形狀和質地,其結構和成分的改變被認為是引起果實質地變化的主要原因[4-6]。在通常情況下,纖維素是所有高等植物細胞壁初生壁和次生壁的主要組成成分之一,它以微纖絲為主要存在方式,被稱為骨架物質,其糖苷網(wǎng)絡控制著細胞的大小和伸長方向,并且與果實硬度呈正相關關系[7-9]。相關研究結果表明,在香蕉果實的后熟軟化過程中,果實中纖維素含量不斷下降;據(jù)莊軍平等[10]報道,香蕉在發(fā)育成熟軟化過程中,果實細胞壁乙醇不溶性物質含量不斷降低;而‘庫爾勒香梨’為脆肉型果實,在成熟期果實細胞壁乙醇不溶性物質含量下降不顯著[11]。在梅、杏果實的生長和成熟過程中,纖維素含量不斷增加,而在桃果實后熟軟化期間的纖維素含量則逐漸減少,從而導致細胞壁結構松散及果實成熟軟化[12]。另有研究表明,隨著東魁楊梅果實成熟度的提高,果實細胞壁中松弛型半纖維素含量和水溶性果膠含量不斷地增加,進而導致果實成熟后細胞壁不斷的軟化[13]。當前研究多以常見薔薇科模式植物果實為主要試驗對象,而楊梅果實構造獨特,究竟是何種原因導致不同楊梅品種間果實硬度差異,還未見研究報道。為此,本試驗以3個不同硬度、質地楊梅品種成熟期的果實為試材,從觀測肉柱細微形態(tài)結構與測定相關生理指標入手,探究了造成楊梅品種間果實硬度差異的可能因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以15年生、冠幅及高度一致、樹勢中庸、掛果適量的3個楊梅品種“荸薺種”、“東魁”和“硬絲安海變”作為試材,于2017年,分別在各個品種果實成熟期采集樹冠朝南方位的健康果實,每個品種設3個重復,每12個果實為1個重復；樣品采集后立即拿回實驗室進行顯微觀測與相關生理指標測定。本研究所用試材的相關具體信息列于表1。

表1 本研究中所選用的楊梅試材

1.2 試驗方法

1.2.1 細微形態(tài)觀察與生理指標測定 試驗所需樣品只取果實赤道部分(寬2 cm的區(qū)域內,大于100個)肉柱,對肉柱的頭部形態(tài)進行描述記錄。參照文獻[14],并將樣品鏡檢前處理方法進行如下改良:切取新鮮果實肉柱,用去離子水洗凈,使用卡諾固定液(甲醇和冰醋酸體積比為3∶1)分3個以上梯度(按照加入去離子水比例,即25%、50%、75%,從低到高)分次固定,每次在4 ℃條件下固定12 h以上;第一次固定時,需使用抽真空器(美吉斯WP300)抽取樣品組織中空氣,時間為30 s;用去離子水將樣品洗凈后在室溫條件下于1%高碘酸溶液中靜置1 h;然后將樣品洗凈后轉入PI(Propidium iodide,碘化丙啶)染色溶液(200 μg/mL)中染色3.0 h;其后轉入水合氯醛溶液(4 g水合氯醛、1 mL甘油和2 mL去離子水)中于室溫條件下靜置過夜;最后再將樣品轉入高濃度水合氯醛溶液(200 g水合氯醛、20 g甘油和50 mL去離子水)中保持至少72 h,直到鏡檢。

將經上述處理的樣品置于ZEISS公司激光共聚焦掃描顯微鏡(LSM 880)下觀察,激發(fā)波長為535 nm。ZEISS熒光顯微鏡的微調由ZEN lite軟件控制,以明場和熒光為觀察方式,光切片步距為0.2 μm。采用Adobe Photoshop CS 5軟件進行圖像后期處理、編輯。

使用TA.XT plus質構儀(英國Stable Micro Systems公司)對果實赤道部位硬度進行測定,單果重復2次;選擇柱型探頭(P/2),步進速度為1 mm/s,測試深度為5 mm。另外,直接使用相關試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)測定果實中纖維素、水溶性果膠、半纖維素、細胞壁乙醇不溶性物質的含量以及相關酶的活性等,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 統(tǒng)計分析 利用DPS(Data Processing System) v 14.10軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并采用鄧肯氏新復極差檢驗法進行多重比較,在α=0.05和α=0.01水平下進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同質地楊梅品種果實肉柱顯微結構分析

2.1.1 果實肉柱形狀與內部結構分析 由圖1-A、圖1-B、圖1-C可知, 楊梅品種荸薺種與東魁的果實肉柱頭部較為圓鈍,而硬絲安海變的肉柱頭部較為尖瘦;同時,東魁的肉柱頭部與肉柱主體存在一個小的臺階狀構造,可能是由內部發(fā)育不夠充實或飽滿所致。3個品種的楊梅果實肉柱主要由大量的薄壁細胞組成,細胞形狀不規(guī)則,排列緊密;越靠近頭部頂端,細胞體積越小;同時,所有品種的肉柱頂端均具有一個凸起的顆粒狀物體,其具體作用還不清楚;此外,在中心位置可見類似維管束狀組織貫穿整個肉柱,與頂端顆粒狀物體相連。圖1-D、圖1-E、圖1-F肉柱橫切面顯微圖顯示,3個楊梅品種果實肉柱間邊界明顯,周長大小不一,均呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形,肉柱間可見空隙,肉柱內靠近中央部位的薄壁細胞體積較小,中心點明顯。

A、B和C分別為楊梅品種荸薺種、東魁和硬絲安海變果實的單個肉柱;D、E和F分別為上述3個品種果實的橫切面。

由表2可知：在不同品種間肉柱橫截面面積、細胞壁厚度與單位面積細胞數(shù)量差異不顯著。就平均值而言,硬絲安海變的細胞壁厚度最大,而荸薺種的細胞壁厚度最??；東魁的單位面積細胞數(shù)量最多,而硬絲安海變的單位面積細胞數(shù)量最少;東魁的肉柱橫截面面積最大,其橫截面細胞數(shù)量極顯著多于另外兩個品種的,可能是大果型楊梅果實的特性之一。

表2 楊梅果實肉柱橫截面顯微構造情況

注:同列數(shù)據(jù)后附不同小寫、大寫字母分別表示在0.05和0.01水平下差異顯著。下同。

2.1.2 果實肉柱橫截面中心部分與頭部表面顯微結構分析 圖2-A、圖2-B表明,肉柱橫截面細胞形狀不規(guī)則,有明顯的細胞間隙,排列緊密;在近肉柱中心區(qū)域,細胞體積有遞減趨勢,而肉柱中心主要為大量直徑小于5 μm的小型細胞,且排列緊密;該構造可能是用來輸導水分、無機鹽等物質的維管束組織。圖3-C、圖3D顯示,果實肉柱靠近頭部區(qū)域均分布有顆粒狀物體,該物體呈近圓形,直徑約為50 μm;值得注意的是,該物體可能會在受到外力作用時脫落,然后在其原來位置周圍可見排成圓形且排列緊密的小型細胞。

2.2 不同質地楊梅品種果實硬度與細胞壁組分含量及相關酶活性

由圖3-A、圖3-B可知：硬絲安海變的果實硬度最高,與荸薺種差異顯著;荸薺種的果實中細胞壁乙醇不溶性物質含量最低,而硬絲安海變的則最高,兩者差異極顯著,這或許暗示果實硬度與細胞壁乙醇不溶性物質含量有一定的相關性。從圖3-C、圖3-D中可以看出,硬絲安海變與東魁的果實纖維素含量均極顯著高于荸薺的,而纖維素酶活性的測定結果剛好與此相反,荸薺種果實中纖維素酶的活性最高,極顯著高于其它2個品種的。圖3-E、圖3-F表明,不同品種果實中半纖維素含量與半纖維素酶活性表現(xiàn)情況相似;其中,荸薺種果實的半纖維素含量與半纖維素酶活性均為最高,與硬絲安海變的差異達到了極顯著水平。在圖3-G、圖3-H中,荸薺種的果實水溶性果膠含量最高,而東魁品種的含量最低,兩者差異達到極顯著水平;而荸薺種的果膠酶活性最低,極顯著低于東魁和硬絲安海變的。

圖2 楊梅果實單個肉柱橫切面中心部分與肉柱頭部顆粒狀物質激光共聚焦顯微圖

A:果實硬度; B:乙醇不溶性物質含量; C:纖維素含量; D:纖維素酶活性;

3 討論與結論

3.1 討論

由于楊梅果實含水量較高,并且無外果皮包被，如果采用常規(guī)的石蠟切片技術,則經脫水、透明、浸蠟等步驟后的楊梅組織逐步收縮,細胞破碎較多,不能保持原有狀態(tài),后期無法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計;若采用冷凍切片技術對楊梅果實肉柱等幼嫩組織進行切片,則可以保存細胞內水溶性和脂溶性內含物,減少對樣品組織的損傷,效果優(yōu)于石蠟切片技術。但是,冷凍切片技術方法針對不同種類的樣品組織,需確立相應的最佳冷凍溫度、冷凍時間及切片厚度等參數(shù)條件[15],否則效果不理想。本研究使用改良的楊梅果實肉柱組織前處理方法,然后置于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡進行觀測,其試驗操作所有環(huán)節(jié)均在室溫下進行,只需對樣品進行簡單的梯度固定、染色和透明化處理即可上鏡觀測,樣品組織幾乎無任何損傷,便于后期進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。目前,激光掃描共聚焦熒光顯微鏡主要用于特異蛋白的胞內定位以及細胞結構特征等方面的研究[16-19],而在用于植物果實組織細微構造方面的研究報道較少[20]。總之,該儀器在植物顯微結構研究中具有廣闊的應用前景,有待進一步深入探索和利用。

楊梅果實肉質柔嫩,不耐貯運，有必要對楊梅果實的力學特性進行透徹的了解。目前對楊梅果實力學特性的研究以模擬壓縮、夾持、墜落等機械損傷形式為主,進而推導出楊梅果實的生物力學參數(shù)[21-23]。至于楊梅果實解剖結構與力學特性之間有何種關系,還未見任何研究報道。根據(jù)有關研究結果,蘋果的損傷體積與其所吸收的能量成正比,吸收的能量造成機械損傷[24];而楊梅品種硬絲安海變的果實肉柱較尖,與外部環(huán)境接觸面積較小,不利于吸收外部機械沖擊或震動產生的能量,這可能是該品種可以在雨天采收和采后選果而果實不發(fā)軟,較其他楊梅品種更適于長途運輸?shù)脑蛑?。另?值得注意的是,在楊梅果實肉柱中存在維管束構造,貫穿直至頭部。在一般情況下,維管束一方面是果實水分和營養(yǎng)物質運輸?shù)闹饕ǖ?；另一方?維管束機械支撐整個肉柱部分;至于維管束與楊梅果實發(fā)育的關系以及對果實品質的影響,目前還沒有任何研究報道?；诰S管束在禾本科作物中的作用研究結果,提高相對維管束面積是提升作物自身抗倒性的有效途徑[25-26]。今后有必要探討楊梅果實肉柱中維管束構造與果實發(fā)育的關系、維管束面積對果實肉柱質地的影響等。

纖維素和半纖維素作為細胞壁的主要骨架物質,其含量多少與果實的硬度、脆韌等密切相關;一般情況下,隨著果實的發(fā)育成熟,纖維素與半纖維素等細胞壁乙醇不溶性物質含量會隨之變化[10]。相關研究表明,果實纖維素含量與硬度呈正相關關系,而水溶性果膠含量隨著果實不斷發(fā)育成熟而逐漸升高,因而被作為評價果實耐貯性的重要標準[9,12]。本研究結果也表明,不同質地楊梅品種的果實纖維素和水溶性果膠含量存在一定差異，其中,較高硬度楊梅品種硬絲安海變的果實纖維素含量極顯著高于荸薺種的,而其水溶性果膠含量極顯著低于荸薺種的。有關研究表明,隨著果實發(fā)育成熟,果實細胞壁中半纖維素含量呈現(xiàn)先增加后急劇減少的趨勢;然而,本研究結果顯示,硬絲安海變的果實半纖維素含量以及半纖維素酶活性極顯著低于荸薺種的,意味著半纖維素含量及其酶活性與果實質地并不總是呈正相關關系,可能是由于品種特性的差異而存在不同的作用機制。

3.2 小結

本研究建立了適于楊梅果實細微結構觀測的樣品前處理方法,并用于激光共聚焦顯微鏡觀測。觀測結果發(fā)現(xiàn)：3個不同質地楊梅品種果實的肉柱柱頭形態(tài)具有一定差異;在所有品種果實肉柱的中心位置均有類似維管束狀組織貫穿。除肉柱橫截面細胞數(shù)量外,不同品種間肉柱橫截面面積、細胞壁厚度與單位面積細胞數(shù)量差異均不顯著;硬絲安海變的果實硬度和細胞壁乙醇不溶性物質含量最高,與荸薺種差異顯著;硬絲安海變與東魁的果實纖維素含量極顯著高于荸薺種的。本研究進一步證實了硬絲安海變?yōu)楦哂捕荣|地楊梅品種;另外,東魁的肉柱橫截面細胞數(shù)量極顯著多于其它2個品種的。果實中細胞壁乙醇不溶性物質含量和纖維素含量可以作為鑒定不同質地楊梅品種的內在生理學指標。

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