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    急性髓系白血病患者外周血WT1基因的表達水平及其與血清IL6、C3、C4的關(guān)系

    2018-05-16 09:21:17何玲吳紅衛(wèi)譚大為
    癌癥進展 2018年4期
    關(guān)鍵詞:髓系白血病外周血

    何玲,吳紅衛(wèi),譚大為

    1成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫血液科,成都 610500

    2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科,貴州 貴陽 5500040

    急性髓系白血病是造血系統(tǒng)的髓系原始細胞克隆性惡性增殖性疾病,是由正常髓系細胞分化發(fā)育過程中造血祖細胞的惡性轉(zhuǎn)變引起的[1],具體的發(fā)病機制尚未完全明確。急性髓系白血病患者體內(nèi)白細胞質(zhì)量差,因此會引發(fā)多種并發(fā)癥,臨床表現(xiàn)主要以感染、持續(xù)性發(fā)熱、皮膚黏膜出血、貧血為主[2]?;熓桥R床治療急性髓系白血病的有效手段,但化療耐藥和緩解后微小殘留病變的根除是臨床治療的棘手問題[3]。因此,尋找急性髓系白血病的血清標志物是臨床治療的關(guān)鍵。研究表明,WT1基因在多種惡性血液疾病中異常表達,其表達水平已成為臨床檢測急性髓系白血病的主要評判指標[4-5]。然而,WT1基因與白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、補體C3及C4表達水平的相關(guān)性尚未見報道。本研究選擇48例急性髓系白血病初治患者、25例急性髓系白血病緩解患者、29例急性髓系白血病復發(fā)患者和19例健康體檢者為研究對象,探討急性髓系白血病患者外周血WT1基因和血清IL-6、C3、C4的表達水平,現(xiàn)報道如下。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象

    選取2015年3月至2017年3月于成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院治療的102例急性髓系白血病患者。所有患者均行血常規(guī)、免疫學、骨髓形態(tài)學、組織化學染色及染色體核型分析,均符合急性髓系白血病的診斷標準,確診為急性髓系白血病。急性髓系白血病初治患者48例,其中男26例,女22例;年齡24~36歲,平均(28.23±4.12)歲。急性髓系白血病緩解患者25例,其中男13例,女12例;年齡22~37歲,平均(27.36±4.22)歲。急性髓系白血病復發(fā)患者29例,其中男16例,女13例;年齡25~36歲,平均(27.82±4.06)歲。選取同期健康體檢者19例為對照組,其中男11例,女 8例;年齡 22~33歲,平均(26.92±4.06)歲。所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。4組研究對象的年齡、性別比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05),具有可比性。

    1.2 診斷標準

    急性髓系白血病的診斷標準:①符合英法美協(xié)作組(FAB協(xié)作組)及世界衛(wèi)生組織(WHO)對急性髓系白血病的診斷標準[6];②符合《血液病診斷及療效分析》對急性髓系白血病的診斷標準[7]。納入標準:①骨髓原始細胞數(shù)≥20%;②伴有特殊染色體類型。排除標準:①伴有t(15;17)和t(8;21)等染色體易位的急性髓系白血病患者;②治療相關(guān)性急性髓系白血病患者;③骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)或骨髓增殖性疾?。╩yeloproliferative disorders,MPD)轉(zhuǎn)化而來的急性髓系白血病患者。

    1.3 主要試劑及儀器

    RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;TaqDNA聚合酶購自北京NEB公司;IL-6、C3、C4酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司;Applied Biosystems熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司。

    1.4 方法

    1.4.1 采集受試者靜脈血 采集受試者空腹靜脈血3~5 ml至無菌的EDTA抗凝管中,置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測受試者外周血WT1 mRNA表達水平 取1.4.1中采集的靜脈血,應用RNA提取試劑盒提取總RNA,應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫中WT1的cDNA序列設(shè)計引物,WT1上游引物為5′-CAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCT-3′,下 游 引 物 為 5′-GAAGTCACACTGGTATGGTTTCTCA-3′;GAPDH上 游 引 物 為 5′-CGTTGGCTTCCCAGAACATCAT-3′,下 游 引 物 為 5′-CATCGGACACATTGGGGGTAG-3′,以GAPDH為內(nèi)參,行進qRT-PCR。PCR反應體系(50 μl):5×PCR緩沖液10 μl,TaqDNA聚合酶 1 μl,上游引物 2 μl,下游引物 2 μl,10 mmol/L dNTP mix 1 μl,cDNA 1 μl,ddH2O 33 μl。PCR 反應條件:95℃、5 min預變性,95℃、30 s變性,64℃、15 s延伸,共40個循環(huán)。采用最大二階導數(shù)法(2-△△Ct)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,計算WT1的相對表達量。△△Ct=(實驗組目的基因Ct平均值-實驗組內(nèi)參基因Ct平均值)-(對照組目的基因Ct平均值-對照組內(nèi)參基因Ct平均值)。

    1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測受試者血清IL-6、C3、C4表達水平 將1.4.1中采集的靜脈血置于超低溫離心機,3000 r/min離心5 min,收集上清液,分別用IL-6、C3、C4酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清IL-6、C3、C4的表達水平,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 外周血WT1 mRNA表達水平的比較

    急性髓系白血病初治組患者的WT1 mRNA表達水平高于對照組,急性髓系白血病緩解組患者的WT1 mRNA表達水平低于急性髓系白血病初治組,急性髓系白血病復發(fā)組患者的WT1 mRNA表達水平高于急性髓系白血病初治組,差異均有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。(表1)

    2.2 血清IL-6、C3、C4表達水平的比較

    急性髓系白血病初治組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于對照組,急性髓系白血病緩解組患者的IL-6、C3、C4表達水平均低于急性髓系白血病初治組,急性髓系白血病復發(fā)組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于急性髓系白血病初治組,差異均有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。(表2)

    表1 4組研究對象外周血WT1 mRNA表達水平的比較(±s)

    表1 4組研究對象外周血WT1 mRNA表達水平的比較(±s)

    注:a與對照組比較,P<0.05;b與急性髓系白血病初治組比較,P<0.05

    WT1 mRNA 0.21±0.05 0.76±0.21a 0.54±0.07a b 0.92±0.18a b對照組(n=19)急性髓系白血病初治組(n=48)急性髓系白血病緩解組(n=25)急性髓系白血病復發(fā)組(n=29)82.440 0.000組別F值P值

    表2 4組研究對象血清IL-6、C3、C4表達水平的比較(±s)

    表2 4組研究對象血清IL-6、C3、C4表達水平的比較(±s)

    注:a與對照組比較,P<0.05;b與急性髓系白血病初治組比較,P<0.05

    組別對照組(n=19)急性髓系白血病初治組(n=48)急性髓系白血病緩解組(n=25)急性髓系白血病復發(fā)組(n=29)F值P值IL-6(ng/ml)0.24±0.03 0.72±0.14a 0.49±0.06a b 0.89±0.15a b 134.928 0.000 C3(g/L)0.46±0.08 0.94±0.15a 0.76±0.12a b 1.22±0.21a b 102.153 0.000 C4(g/L)0.32±0.05 0.75±0.17a 0.52±0.08a b 0.94±0.18a b 81.530 0.000

    2.3 外周血WT1 mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平的相關(guān)性

    急性髓系白血病初治組患者的外周血WT1mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平均呈正相關(guān)(P﹤0.05)。(表3)

    表3 急性髓系白血病初治組患者外周血WT1 mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平的相關(guān)性

    3 討論

    急性髓系白血病是一種非淋巴細胞來源的急性白血病,發(fā)病率和病死率較高[8]。研究表明,隨著居住環(huán)境的惡化(電離輻射、化學物質(zhì)等),急性髓系白血病的發(fā)病率逐年攀升[9]。有資料顯示,2014年美國新發(fā)18 860例急性髓系白血病患者,其中死亡人數(shù)為10 460例,嚴重威脅人們的身體健康和生命安全[10]。迄今為止,造血干細胞移植和化療是臨床治療急性髓系白血病的主要手段,但中國造血干細胞樣本不足,且干細胞移植費用昂貴,化療藥物的不良反應大,化療在殺死腫瘤細胞的同時,也會極大程度地抑制患者正常干細胞的造血功能和免疫功能[11]。隨著分子生物學的發(fā)展,基因診斷和靶向治療逐漸受到醫(yī)學工作者的青睞。

    WT1基因是腫瘤抑制基因,于1990年由Call等[12]從Wilms瘤細胞的染色體11p13位點分離出來。WT1基因能夠編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子,抑制造血干細胞的增殖和分化,與惡性血液疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。WT1基因是白血病中常見的一種異常高表達的基因,但其高表達機制尚未完全明確。李凌浩等[15]研究表明,急性髓系白血病患者的WT1基因表達水平明顯高于非白血病患者,提示W(wǎng)T1基因在急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后中發(fā)揮重要作用。張熔等[16]研究表明,WT1基因在急性髓系白血病復發(fā)患兒中的表達水平明顯升高,提示W(wǎng)T1基因可以作為無染色體易位或基因融合的急性髓系白血病患兒復發(fā)的評判指標。邊志磊[17]的研究表明,在急性髓系白血病患者的骨髓細胞中,WT1基因的表達水平明顯高于非白血病患者;且WT1基因高表達患者的預后較WT1基因低表達患者差。本研究結(jié)果表明,急性髓系白血病初治組患者的WT1mRNA表達水平高于對照組,急性髓系白血病緩解組患者的WT1mRNA表達水平低于急性髓系白血病初治組,急性髓系白血病復發(fā)組患者的WT1mRNA表達水平高于急性髓系白血病初治組,差異均有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05),與上述研究結(jié)果一致。

    白細胞介素(interleukin,IL)最初在白細胞中發(fā)現(xiàn),后來在多種細胞中均能檢測到這一類細胞因子。目前發(fā)現(xiàn)的IL有38種,根據(jù)其結(jié)構(gòu)的同源性分為IL-1家族、IL-6家族、IL-10家族、腫瘤壞死因子家族和造血因子家族等多個家族,IL-6基因位于人類的第7號染色體上,存在于多種細胞中,如T細胞、B細胞、內(nèi)皮細胞等。IL-6是一種重要的造血調(diào)節(jié)因子,與造血干細胞和白細胞的增殖和分化密切相關(guān)。李敏敏等[18]研究表明,初診及骨髓未達完全緩解的白血病患兒中,急性髓系白血病患兒的骨髓IL-6水平高于急性淋巴細胞白血病患兒(P﹤0.05);處于完全緩解期的不同類型白血病緩解患兒的骨髓IL-6表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05);骨髓緩解及未緩解的低、中、高?;純旱腎L-6表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);結(jié)果提示,IL-6在急性淋巴細胞白血病患者中的表達水平不會出現(xiàn)異常,但在急性髓系白血病患者中的表達水平異常升高,說明IL-6的表達水平與白血病的類型及腫瘤負荷有關(guān)。何光翠等[19]研究表明,IL-6與急性髓系白血病原始細胞的生長密切相關(guān),可以通過調(diào)控IL-6的表達來調(diào)節(jié)急性髓系白血病原始細胞的生長。補體系統(tǒng)是天然免疫的重要組成部分,一直以來不少學者認為補體系統(tǒng)能夠有效抑制腫瘤發(fā)生。但近年來有研究表明,補體能夠分泌與腫瘤生成相關(guān)的生長因子,激活與腫瘤相關(guān)的信號通路,誘導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[20],但補體系統(tǒng)在急性髓系白血病患者中的作用尚未見報道。本研究結(jié)果表明,急性髓系白血病初治組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于對照組,急性髓系白血病緩解組患者的IL-6、C3、C4表達水平均低于急性髓系白血病初治組,急性髓系白血病復發(fā)組患者的IL-6、C3、C4表達水平均高于急性髓系白血病初治組,差異均有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05),且急性髓系白血病初治患者的外周血WT1 mRNA與血清IL-6、C3、C4表達水平均呈正相關(guān)(r=0.421,P=0.032;r=0.406,P=0.021;r=0.454,P=0.001)。提示W(wǎng)T1 mRNA、IL-6、C3、C4與急性髓系白血病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

    綜上所述,WT1 mRNA、IL-6、C3、C4在急性髓系白血病患者中呈高表達,提示W(wǎng)T1、IL-6、C3、C4參與急性髓系白血病的發(fā)生和發(fā)展,可為急性髓系白血病的臨床診斷及靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

    參考文獻

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