分階段酶解法與膜處理結(jié)合制備楊梅汁工藝研究

樓樂(lè)燕，沈清，尹培，陳健初，葉興乾

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江杭州310058）

楊梅（Myrica Rubra Sieb.et Zucc）為楊梅科楊梅屬常綠喬木植物，是我國(guó)亞熱帶特有的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)樹種和生態(tài)樹種[1]。其果實(shí)的可食率達(dá)到90%以上，除了富含糖、有機(jī)酸和多種維生素以外，還含有花色苷和類黃酮成分[2-5]。楊梅成熟期較短，季節(jié)性較強(qiáng)，主要集中在6月中下旬，適逢高溫梅雨季節(jié)，且果實(shí)為柱狀突起，汁水豐富，采后呼吸旺盛，在貯藏和運(yùn)輸中易受傷害，保鮮期非常短。因此，將楊梅加工成楊梅制品成為一種緩解銷售壓力、增加楊梅利用率的重要手段。目前楊梅的相關(guān)產(chǎn)品有果脯[6]、果酒[7]、果醋[8]、楊梅汁[9-10]等。其中楊梅汁作為一種果蔬汁，不僅色澤艷麗、酸甜可口，而且能保留花色苷、抗壞血酸等活性物質(zhì)，具有一定的保健功能，開發(fā)潛力巨大。

楊梅原汁中含有大量的細(xì)胞壁碎塊、纖維素、果膠、蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)，只用離心和過(guò)濾等簡(jiǎn)單方法較難得到澄清的果汁[11]。在楊梅汁的加工、銷售和貯藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)和果膠都是導(dǎo)致楊梅汁渾濁的重要因素。目前，用于楊梅果汁澄清的方法主要有酶法澄清、膜處理法、澄清劑澄清法等[12]。用明膠-單寧、殼聚糖、硅藻土等澄清劑對(duì)楊梅汁進(jìn)行澄清處理是前人研究較多的方法[13]，此種方法耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)楊梅中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞程度較大，可能使果汁產(chǎn)生異味。酶法澄清可以較好的保留營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是影響酶反應(yīng)的因素較多，例如，底物濃度與酶濃度的關(guān)系、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等。膜處理法可以得到高澄清度的果汁，但是果汁在處理前需預(yù)先達(dá)到一定的澄清度，否則過(guò)多的大分子物質(zhì)容易堵住濾膜，而頻繁更換濾膜則會(huì)加長(zhǎng)操作時(shí)間，降低澄清效率。果膠酶酶解澄清技術(shù)在藍(lán)莓[14-15]，楊梅[16]，黑莓[17]等果實(shí)中均有報(bào)道，但有關(guān)蛋白酶-果膠酶對(duì)楊梅汁的酶解工藝研究未見報(bào)道。因此，本論文楊梅清汁制備工藝結(jié)合酶法和膜處理法，先采用蛋白酶和果膠酶進(jìn)行分階段酶解楊梅原汁中部分蛋白質(zhì)和果膠，再通過(guò)膜處理進(jìn)一步澄清果汁，并通過(guò)正交試驗(yàn)探究出最佳的酶解工藝。研究結(jié)果為今后工業(yè)化生產(chǎn)楊梅清汁飲料提供技術(shù)參數(shù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺種楊梅采自浙江寧波慈溪，立即冷藏至-18℃冰箱。

中性蛋白酶（20萬(wàn) U/g）、纖維素酶（5萬(wàn) U/g）、α-淀粉酶（1萬(wàn)U/g）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；果膠酶（3萬(wàn)U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；福林酚試劑、無(wú)水乙酸鈉（分析純）、氯化鉀（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-10數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″仯航饓锌平軆x器廠；UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo Fisher公司；Color Flex EZ全自動(dòng)色差計(jì)：美國(guó)Hunt Lab顏色管理公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅汁制備工藝

楊梅解凍→打漿→4層紗布粗濾→蛋白酶酶解、滅酶、離心過(guò)濾→果膠酶、纖維素酶、α淀粉酶酶解，滅酶，離心過(guò)濾→膜處理→澄清果汁

1.3.2 酶解單因素試驗(yàn)

對(duì)蛋白酶的添加量、蛋白酶酶解溫度、果膠酶添加量、果膠酶酶解溫度進(jìn)行探究。確定纖維素酶添加量為0.3 g/L，α-淀粉酶添加量為0.2 g/L，在本試驗(yàn)中不做探究。

1.3.2.1 探究蛋白酶用量對(duì)果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶，其用量分別為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g，蛋白酶酶解階段溫度60℃，酶解時(shí)間2 h后。果膠酶添加量0.15 g，果膠酶解階段溫度45℃，酶解時(shí)間2 h。

1.3.2.2 探究蛋白酶酶解溫度對(duì)果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶0.03 g，分別控制蛋白酶酶解階段溫度 45、50、55、60、65 ℃，酶解時(shí)間2 h。果膠酶添加量0.15 g，果膠酶酶解階段溫度45℃，酶解時(shí)間2 h。

1.3.2.3 探究果膠酶用量對(duì)果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶0.03 g，蛋白酶酶解階段溫度60℃，酶解時(shí)間2 h。添加果膠酶，用量分別為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g，果膠酶解階段溫度為45℃，酶解時(shí)間2 h。

1.2.3.4 探究果膠酶酶解溫度對(duì)果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶0.03 g，蛋白酶酶解階段溫度60℃，酶解時(shí)間2 h。果膠酶添加量0.15 g，分別控制果膠酶酶解階段溫度 40、45、50、55、60℃，酶解時(shí)間2 h。

1.3.3 酶解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化楊梅汁加工過(guò)程中分階段酶解的工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 楊梅汁酶解工藝正交試驗(yàn)因素水平Table1 Factorsand levelsof orthogonalexperiment

1.3.4 膜處理

將在正交試驗(yàn)優(yōu)化所得的最優(yōu)酶解條件下處理的楊梅汁進(jìn)行膜過(guò)濾，得到澄清度更高的楊梅汁。

1.3.5 主要指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.5.1 透光率的測(cè)定

以蒸餾水為參比溶液，在720 nm處測(cè)定楊梅汁的透光率。

1.3.5.2 花色苷的測(cè)定

花色苷的測(cè)定采用賈娜等[18]的pH示差方法并稍作修改。取兩個(gè)10mL容量瓶各加入1mL的楊梅汁，分別用pH1.0的緩沖液（0.2mol/LKCl∶0.2mol/LHCl=25∶67（體積比）和pH4.5緩沖液（1mol/LNaAc∶1mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90（體積比）定容，在冰箱中避光靜置2 h。分別在520 nm和700 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)，花色苷含量按下式計(jì)算，結(jié)果以矢車菊3-葡萄糖苷計(jì)。

式中：A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；MW為矢車菊3-葡萄糖苷的相對(duì)分子量449.2；DF為稀釋倍數(shù)10；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900；1為比色皿的光程。

1.3.5.3 色差的測(cè)定

全自動(dòng)色差儀直接測(cè)定。

1.3.5.4 總酚的測(cè)定

總酚的測(cè)定采用福林酚法[19]，并稍作修改。取0.1mL樣品，加1mL福林酚試劑，混合均勻后暗處放置5min，加5mL 5%碳酸鈉溶液，加蒸餾水至25mL，混合均勻后室溫放置1 h，760 nm下測(cè)吸光值。

1.3.5.5 可溶性固形物的測(cè)定

手持式糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.6 蛋白含量測(cè)定

使用碧云天Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶添加量對(duì)楊梅汁澄清效果的影響

分析蛋白酶添加量對(duì)楊梅汁澄清效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 蛋白酶添加量對(duì)果汁透光率的影響Fig.1 Changesof juice transm ittancew ith addition of protease

由圖1可知，蛋白酶添加量對(duì)楊梅汁透光率的影響較大，當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繛?.05 g/L時(shí)，果汁透光率僅為73.23%；當(dāng)添加量增加至0.1 g/L時(shí)，透光率升至87.17%，與0.05 g/L相比，差異顯著。當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿坷^續(xù)增加時(shí)，透光率反而降低，這有可能是因?yàn)槟鼙环磻?yīng)的底物已經(jīng)完全被分解，再持續(xù)增加酶用量，不但不會(huì)使酶促反應(yīng)速率增加反而會(huì)限制酶促反應(yīng)的速率，使得酶解效果不明顯。且蛋白酶添加量0.15、0.2、0.25 g/L 3種酶濃度對(duì)果汁的澄清效果無(wú)顯著差異。綜合考慮選取蛋白酶添加量三水平分別為0.1、0.15、0.2 g/L。

2.2 蛋白酶解溫度對(duì)楊梅汁澄清效果的影響

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率影響較大，當(dāng)溫度未達(dá)到反應(yīng)最適溫度時(shí)，溫度升高，酶促反應(yīng)的速率加快；當(dāng)溫度超過(guò)反應(yīng)的最適溫度時(shí)，酶促反應(yīng)速率逐漸下降；當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，酶逐漸變性失活蛋白酶酶解溫度對(duì)楊梅汁透光率的影響見圖2。

圖2 蛋白酶酶解溫度對(duì)楊梅汁透光率的影響Fig.2 Changesof juice transm ittancew ith proteasehydrolysis temperature

由圖2可知，當(dāng)?shù)鞍酌附夥磻?yīng)溫度在45℃～60℃時(shí)，果汁的透光率逐漸升高，說(shuō)明酶促反應(yīng)速率加快。當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，果汁透光率降低，酶促反應(yīng)速率減緩。55、60、65℃3種溫度下蛋白酶對(duì)楊梅汁澄清效果的影響無(wú)顯著性差異。

2.3 果膠酶添加量對(duì)楊梅汁澄清效果的影響

果膠酶添加量對(duì)楊梅汁透光率的影響見圖3。

圖3 果膠酶添加量對(duì)楊梅汁透光率的影響Fig.3 Changesof juice transm ittancew ith addition of pectinase

從圖3可以看出，當(dāng)果膠酶添加量小于0.75 g/L時(shí)，楊梅汁的透光率與果膠酶的添加量呈正相關(guān)；當(dāng)果膠酶含量為0.75 g/L時(shí)，楊梅汁透光率最高，為85.2%。當(dāng)果膠酶添加量大于0.75 g/L時(shí)，隨著果膠酶用量的增加，楊梅汁的透光率呈下降趨勢(shì)。因此初步確定果膠酶添加量為0.75 g/L。

2.4 果膠酶酶解溫度對(duì)楊梅澄清效果的影響

果膠酶酶解溫度對(duì)楊梅汁透光率的影響見圖4。

圖4 果膠酶酶解溫度對(duì)楊梅汁透光率的影響Fig.4 Changesof juice transm ittancewith pectinasehydrolysis temperature

由圖4可知，當(dāng)酶解溫度小于45℃時(shí)，楊梅汁的透光率隨著溫度的上升而升高；當(dāng)酶解溫度大于45℃時(shí)，楊梅汁的透光率隨著溫度的上升而下降。在45℃～55℃時(shí)，下降趨勢(shì)較緩慢，說(shuō)明此溫度區(qū)間內(nèi)果膠酶的催化活性較高，這與孔祥佳等[16]的報(bào)道一致。當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，楊梅汁透光率僅有66.4%，說(shuō)明此時(shí)果膠酶可能已經(jīng)由于高溫而變性失活。因此選取果膠酶酶解的較適溫度為50℃。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

為了進(jìn)一步選擇最優(yōu)的酶解工藝條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取蛋白酶用量（A）、蛋白酶解溫度（B）、果膠酶用量（A）、果膠酶解溫度（D）四因素，進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2。

表2 楊梅汁酶解工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table2 Resultsand rangeanalysisof orthogonalexperimental

續(xù)表2 楊梅汁酶解工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Continue table2 Resu ltsand rangeanalysisof orthogonal experimental

由表2可知，楊梅清汁制備過(guò)程中酶解階段各試驗(yàn)因素的主次影響為D＞C＞B＞A，即果膠酶用量＞果膠酶酶解溫度＞蛋白酶酶解溫度＞蛋白酶用量。酶解階段最優(yōu)工藝條件組合為A1B3C3D2，即添加0.1g/L蛋白酶，控制蛋白酶酶解階段溫度65℃，果膠酶添加量為1g/L，果膠酶酶解階段溫度50℃。在此最優(yōu)工藝條件組合下進(jìn)行楊梅清汁透光率的重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得楊梅汁透光率為（89.63±0.51）%。

2.6 楊梅汁澄清前后各項(xiàng)指標(biāo)分析

各階段處理前后楊梅汁各項(xiàng)成分比較見表3，不同處理后的楊梅汁實(shí)物圖見圖5。

表3 各階段處理前后楊梅汁各項(xiàng)成分比較Table3 Comparison of the com ponentsof bayberry juicebefore and after treatments

由表3和圖5可以看出，用蛋白酶—果膠酶澄清楊梅汁，其澄清度有了明顯的提高，此時(shí)可以較快速的通過(guò)0.2μm的醋酸纖維膜，大大縮短膜處理的時(shí)間，制備得到的楊梅清汁透光率可達(dá)95%以上。酶解處理后，楊梅汁的L*，a*，b*值都有所提高，其中L*值表示亮度，a*值為正表示紅色，為負(fù)表示綠色，b*值為正表示黃色，為負(fù)表示藍(lán)色。說(shuō)明果汁變得更加透亮，色澤更加亮麗。但是花色苷的含量損失較多，酶解后僅為原汁的55.54%，再經(jīng)過(guò)膜處理后又有略微的減少?？赡苁怯捎趦蓚€(gè)階段的酶解溫度較高，花色苷在高溫下極不穩(wěn)定從而降解造成的[20]。經(jīng)過(guò)蛋白酶酶解后，部分蛋白質(zhì)被酶解，但還有將近一半的蛋白質(zhì)還存留在果汁中，再經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾，除去了幾乎所有的蛋白質(zhì)，可以有效避免后續(xù)貯藏過(guò)程中蛋白-多酚類沉淀的產(chǎn)生。此外，本工藝條件制備下，果汁的糖度和酸度變化較小，基本保持不變。

圖5 不同處理后的楊梅汁實(shí)物圖Fig.5 The pictureof bayberry juicewith different treatments

3 結(jié)論

采用蛋白酶-果膠酶分階段處理和膜過(guò)濾相結(jié)合澄清楊梅汁，可在較短的時(shí)間內(nèi)得到透光率高達(dá)95.27%的楊梅清汁。在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝中蛋白酶用量、蛋白酶酶解溫度、果膠酶用量、果膠酶酶解溫度進(jìn)行優(yōu)化，得到酶解階段的最優(yōu)工藝參數(shù)：蛋白酶用量0.1 g/L，蛋白酶酶解溫度65℃，果膠酶用量1 g/L，果膠酶酶解溫度50℃，在此最優(yōu)條件下制備的楊梅汁透光率可達(dá)89.63%，與楊梅粗汁相比，極顯著的提高了果汁的澄清度。

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