過表達(dá)hsa-miR-202對非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

潘雷，殷俊，傅文凡，戴璐，張烽，趙健

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州510095)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的一線化療方案是以鉑類藥物為主的聯(lián)合化療。順鉑是最常用的鉑類藥物[1]。順鉑耐藥是NSCLC化療失敗的主要原因之一，目前對其耐藥機(jī)制尚不明確。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25 nt的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA互補(bǔ)配對在轉(zhuǎn)后水平進(jìn)行調(diào)控，繼而抑制mRNA翻譯，從而形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中異常表達(dá)的miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥密切相關(guān)[3～8]。let-7是最早在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類miRNA，hsa-miR-202是其成員之一[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管癌、膽囊癌等惡性腫瘤中hsa-miR-202具有抑癌基因作用[4～8]。但hsa-miR-202在NSCLC細(xì)胞化療耐藥中的作用尚不清楚。2017年3～10月，本研究觀察了過表達(dá)hsa-miR-202對NSCLC順鉑耐藥細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP(以下稱A549/DDP細(xì)胞)，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所保存。miRNA引物、hsa-miR-202模擬物(hsa-miR-202 mimic)及陰性對照模擬物(mimic NC)，由廣州銳博生物科技有限公司合成。CO2恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、水平層流超凈工作臺，德國Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡，德國Leica公司；普通PCR儀，德國Eppendorf公司；7500型實(shí)時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；多功能酶標(biāo)儀，美國BioTEK公司；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀，美國BD公司。RPMI 1640完全培養(yǎng)基、FBS及0.25%胰蛋白酶消化液，美國Corning公司；順鉑及噻唑藍(lán)(MTT)，美國Sigma公司；DNA/RNA共提取試劑盒、QuantScript RT Kit及Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)，天根生化科技(北京)有限公司；Lipofectamine2000 Reagent、TRIzol，美國Invitrogen公司；FITC Annexin Ⅴ and PI Apoptosis Kit及All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit，美國GeneCopoeia公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 取A549/DDP細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合約90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代。取傳3代對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 取對數(shù)生長期A549/DDP細(xì)胞接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液)，每孔1×105個。隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組、hsa-miR-202組。常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，陰性對照組、hsa-miR-202組按Lipofectamine2000 Reagent說明分別轉(zhuǎn)染mimic NC、hsa-miR-202 mimic，空白對照組不予轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測OD260/OD280為1.8～2.0、瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整。然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL，All-in-OneTMmiRNA qPCR Primer 2 μL，Universal Adaptor PCR Primer PCR 2 μL，cDNA 2 μL，無核酶水4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，空白對照組hsa-miR-202相對表達(dá)量為1.00±0.11，陰性對照組為1.63±0.15，hsa-miR-202組為381.09±31.42。hsa-miR-202組hsa-miR-202相對表達(dá)量明顯高于空白對照組、陰性對照組(P均<0.05)，空白對照組與陰性對照組比較P>0.05。表明此方法能將hsa-miR-202瞬時轉(zhuǎn)染入A549/DDP細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 細(xì)胞增殖能力 采用MTT法。取對數(shù)生長期A549/DDP細(xì)胞，按1.3中的方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，接種于96孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液)，每孔1×103個。分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120 h加5 g/L MTT溶液10 μL孵育4 h，吸出孔內(nèi)液體，加入DMSO 150 μL，震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔的OD值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=各組每天OD570值/第1天OD570值×100%。

1.4.2 細(xì)胞集落形成個數(shù) 采用平板集落形成實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期A549/DDP細(xì)胞，按1.3中的方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液)，每孔500個。常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3天換液，培養(yǎng)至第10天，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入甲醇1 mL，- 20 ℃固定30 min；棄去甲醇，每孔加入1%結(jié)晶紫染色液1 mL，室溫染色10 min；棄去結(jié)晶紫染色液，緩慢漂洗6孔板，計(jì)數(shù)細(xì)胞集落形成個數(shù)。

1.4.3 細(xì)胞周期 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按1.3中的方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，去上清；用預(yù)冷的PBS洗滌2次，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，去上清；加入預(yù)冷的70%乙醇1 mL重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，去上清；加入細(xì)胞染色緩沖液0.5 mL及碘化丙啶(PI)25 μL混勻，室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測各周期細(xì)胞所占比例。

1.4.4 細(xì)胞凋亡率 采用FITC Annexin V/PI雙染法。取對數(shù)生長期A549/DDP細(xì)胞，按1.3中的方法進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h，將細(xì)胞置于含2 μg/mL順鉑的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，去上清；用預(yù)冷的PBS洗滌2次，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，去上清；加入結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，然后加入FITC Annexin V 5 μL和PI 2 μL混勻；室溫避光孵育15 min，加入結(jié)合緩沖液400 μL重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 三組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)不同時間細(xì)胞增殖能力比較 見表1。

表1 三組轉(zhuǎn)染24 h再培養(yǎng)不同時間細(xì)胞增殖能力比較

注：與空白對照組同時間比較，*P<0.05；與陰性對照組同時間比較，#P<0.05。

2.2 三組細(xì)胞集落形成個數(shù)比較 空白對照組、陰性對照組、hsa-miR-202組細(xì)胞集落形成個數(shù)分別為(237±20)、(222±17)、(172±27)個。hsa-miR-202組細(xì)胞集落形成個數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組(P均<0.05)，空白對照組與陰性對照組比較P>0.05。

2.3 三組各周期細(xì)胞所占比例比較 見表2。

表2 三組各周期細(xì)胞所占比例比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.4 三組細(xì)胞凋亡率比較 空白對照組、陰性對照組、hsa-miR-202組細(xì)胞凋亡率分別為(2.93±0.22)%、(3.17±0.17)%、(5.54±0.37)%。hsa-miR-202組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組(P均<0.05)，空白對照組與陰性對照組比較P>0.05。

3 討論

NSCLC順鉑耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，由于順鉑與細(xì)胞內(nèi)組分作用的非特異性及順鉑損傷DNA誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的多樣性，任何影響順鉑與DNA結(jié)合及干擾細(xì)胞凋亡的因素均可導(dǎo)致NSCLC化療耐藥的發(fā)生[9]。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡機(jī)制異常、DNA修復(fù)損傷增強(qiáng)、藥物攝取異常所致細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度降低等可能與順鉑耐藥有關(guān)[10]。

let-7家族成員共有17個，多為抑癌基因，其低表達(dá)時可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，繼而引進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且可能與化療耐藥有關(guān)[11，12]。hsa-miR-202是let-7家族成員之一，亦具有抑癌基因作用[13]。Yang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-202能通過PI3K/Akt、Wnt/β-catenin信號通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲。Meng等[5]研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-202過表達(dá)可使食管鱗癌細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制可能是hsa-miR-202靶向作用于HSF2/Hsp70，繼而抑制半胱氨酸蛋白酶3。Deng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-202靶向作用于FOXR2基因負(fù)向調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。Yi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-202通過直接靶向細(xì)胞周期蛋白D1抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。以上研究結(jié)果表明，hsa-miR-202能夠抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。let-7作為抑癌基因，可抑制K-Ras、C-MYC等癌基因和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白[14]。魏輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，let-7a可通過作用于靶基因Ras抑制ERK表達(dá)，從而調(diào)控MAPK通路，使肺癌G0/G1期細(xì)胞比例增加，繼而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。Hua等[16]研究發(fā)現(xiàn)，let-7低表達(dá)可加速肺癌干細(xì)胞樣群中側(cè)群細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)和促進(jìn)體外干細(xì)胞增殖。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，let-7c通過靶向整合素β3和絲裂原蛋白激酶3抑制NSCLC的遷移和侵襲。因此推測，同為let-7家族的hsa-miR-202可能亦作用于上述基因或信號通路，從而影響DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖和凋亡等，有可能影響NSCLC細(xì)胞對順鉑的敏感性。

本研究結(jié)果顯示，A549/DDP細(xì)胞過表達(dá)hsa-miR-202后，細(xì)胞增殖速度明顯降低，細(xì)胞集落形成個數(shù)明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯升高；表明過表達(dá)hsa-miR-202可抑制A549/DDP細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，具有抑癌基因作用，與張艷等[18]報(bào)道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)hsa-miR-202的A549/DDP細(xì)胞G1期所占比例明顯增加，G2期、S期所占比例明顯減少，提示過表達(dá)hsa-miR-202可使A549/DDP細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，與庹秀林等[19]報(bào)道一致。

綜上所述，過表達(dá)hsa-miR-202能夠抑制A549/DDP細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。但其具體分子機(jī)制尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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