紅薯莖尖愈傷組織胚狀體的誘導研究

武延生，張海濤，牛偉濤，武麗娜，王僧虎，郭 麗

（邢臺學院化學工程與生物技術(shù)學院，河北邢臺 054001）

紅薯（Ipomoea batatas），一年生草本植物，屬薯類糧食作物，原產(chǎn)北美，明末傳入我國，以其抗逆性高、產(chǎn)量高、口味甘甜、吃法多樣，受到我國廣大民眾喜愛并得以廣泛推廣。在新的歷史條件下，人們逐漸認識到紅薯營養(yǎng)物質(zhì)豐富、全面，營養(yǎng)價值不亞于傳統(tǒng)主食米和面；作為藥食同源的食物，在抑癌、改善肝功能、預(yù)防糖尿病等方面效果明顯[1]。

紅薯一般以扦插方式繁殖，在栽培時勞動成本很高，我國每年的紅薯種植面積占全世界的65.4%，產(chǎn)量占世界的85.9%[2]，在栽培過程中所產(chǎn)生的勞動力成本是相當可觀的。胚狀體是體細胞以無性的方式產(chǎn)生的類似于合子胚的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育過程也與合子胚一樣，與母體無微管束相連，易于與母體分離[3]，故而胚狀體是制作人工種子的合適材料。目前，已從多種植物器官獲得胚狀體[4]。Nielsen首次報道用紅薯莖尖分生組織培養(yǎng)成無病毒植株以來，紅薯組織培養(yǎng)的發(fā)展一度十分迅速[5]，在許多方面均獲得了一定的結(jié)果，但在以后幾年中，幾無進展。在本研究中，力圖通過紅薯幼莖愈傷組織的胚狀體誘導研究為人工種子研制奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料、藥品和方法

1.1 材料 “栗子香”紅薯塊根，要求無病蟲害、霉爛、畸形，表面光潔。

1.2 藥品 所用試劑均為國產(chǎn)，NH4NO3、KNO3、KH2PO4、 MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2·H2O、FeSO4·7H2O、EDTA·Na2、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸為分析純。2,4-D，純度98%。

1.3 試驗方法 通過查閱文獻，確定培養(yǎng)基的構(gòu)成為MS無機鹽+500μmol/L肌醇+10 μmol/L煙酸+5μmol/L鹽酸硫胺素+5μmol/L鹽酸吡哆醇，命名為MS’培養(yǎng)基[6]。激素在由外植體到愈傷組織再到胚狀體的分化過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]，本研究著重探索2,4-D在誘導紅薯胚狀體整個過程中的作用。

表1 紅薯莖尖愈傷組織胚狀體誘導過程

2 結(jié)果分析與討論

2.1 紅薯幼莖的培養(yǎng) 在培養(yǎng)盤中裝入校園試驗田挖取的土壤，將選取的紅薯塊根半掩蓋于土壤中，灌水充分洇濕，放入光照培養(yǎng)箱，30℃，培養(yǎng)1周左右長出幼芽（圖1）。在此過程中需保持土壤濕潤和一定的光照，并注意防治病蟲害，如有蟲蝕霉爛，則摒棄整枝。

圖1 紅薯塊根不定芽的萌發(fā)和生長

2.2 紅薯愈傷組織的誘導 取含有莖尖分生組織的幼莖尖端部分，用自來水沖洗15～20min，將附著的泥沙、塵土等洗去，風干，用75%乙醇浸泡1～2min，再用0.2%升汞浸泡10～15min，最后用無菌水沖洗3遍，在超凈工作臺上接種到添有5μmol/L 2,4-D的MS’培養(yǎng)基中，注意在外植體上多劃幾刀，以利于愈傷組織的形成，置于25℃光照培養(yǎng)箱中，光照12L/12D，培養(yǎng)10d左右，切口處呈微隆起狀，體視鏡下可見在該處產(chǎn)生薄壁細胞，這些細胞較內(nèi)部細胞體積大、透明，這是愈傷組織初始形成階段。初始形成的愈傷組織不能形成胚狀體，稱為非胚性愈傷組織，隨時間延長，愈傷組織的外觀生物學特征也越來越明顯，形成了可產(chǎn)生胚狀體的愈傷組織（表2，圖2），即胚性愈傷組織。據(jù)統(tǒng)計，由非胚性愈傷組織形成胚性愈傷組織的概率為17.9%。

表2 胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織的比較

圖2 紅薯幼莖愈傷組織的類型

2.3 繼代培養(yǎng) 將已長出的愈傷組織劃傷口后轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)2～3代，每代間隔25d，培養(yǎng)條件同上，均在無菌條件下進行。愈傷組織經(jīng)2～3代繼代培養(yǎng)后，體積明顯增大。由于愈傷組織是一種能迅速增殖的細胞團，其在適宜的營養(yǎng)條件下，能吸收大量營養(yǎng)物質(zhì)并迅速增殖，在外觀形態(tài)上表現(xiàn)為體積的明顯增大（圖3）。

圖3 繼代培養(yǎng)的愈傷組織

圖4 紅薯幼莖愈傷組織胚狀體

2.4 紅薯胚狀體的誘導 待胚性愈傷組織長至2cm3左右時，將其轉(zhuǎn)接于去除2,4-D的MS’培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)9～11d，胚性愈傷組織質(zhì)地逐漸緊密，并在表面形成許多明顯的瘤狀小突起，隨著瘤狀小突起體積增大，最終形成胚狀體狀結(jié)構(gòu)（圖4）。

愈傷組織和胚狀體的誘導因植物種類、部位和所用激素類型而有較大差異，在本次研究中，以紅薯莖尖為試材，采用2,4-D誘導獲得了紅薯莖尖愈傷組織，去除2,4-D后繼續(xù)培養(yǎng)獲得了胚狀體狀結(jié)構(gòu)。這說明2,4-D在紅薯莖尖愈傷組織和胚狀體的形成過程發(fā)揮著重要作用，以紅薯莖尖通過愈傷組織誘導胚狀體的路徑是可行的，為紅薯人工種子的研制奠定了基礎(chǔ)。

（收稿：2017-12-29）

參考文獻：

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[2]劉慶昌.紅薯在我國糧食和能源安全中的重要作用[N].科技導報,2004.

[3]秦明波,云月.植物生物技術(shù)講座（七）——植物體細胞胚胎發(fā)生和人工種子[J].生物學通報,1994,29):24-6.

[4]周俊彥.植物體細胞在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體I.植物體細胞的胚狀體發(fā)生[J].植物生理學報,1981,7(4):389-97.

[5]張寶紅,豐嶸.紅薯體細胞胚發(fā)生和人工種子的制作[J].西北農(nóng)業(yè)大學學報,1993,21(3):82-7.

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[7]崔紅,陳睦傳.紅薯生物技術(shù)研究進展[J].植物學通報,1999,16(6):653-7.

[8]侯丙凱,鮑雪珍,于惠敏,et al.葡萄離體培養(yǎng)中胚狀體發(fā)生的研究I.胚狀體發(fā)生的組織細胞學觀察 [J].山東大學學報 (自然科學版),1997,32(2):208-12.

[9]崔紅,王偉,陳亮,et al.紅薯不同類型愈傷組織的比較[J].廈門大學學報(自然科學版),2000,39(1):116-21.