王凌星,黃紅紅,呂國(guó)榮
(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院B超室,3.泉州醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,泉州362000)
神經(jīng)發(fā)生是指由神經(jīng)干/前體細(xì)胞形成神經(jīng)元的過(guò)程,神經(jīng)干細(xì)胞是具有自我更新和分化能力的不成熟細(xì)胞,能夠分化成神經(jīng)元和星形或少突膠質(zhì)細(xì)胞。大腦海馬的神經(jīng)發(fā)生會(huì)受產(chǎn)前不良環(huán)境影響:妊娠早期或晚期的產(chǎn)前應(yīng)激均會(huì)抑制幼年子代恒河猴海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生[1],產(chǎn)前藥物、酒精暴露或妊娠期母體睡眠剝奪均會(huì)改變青年子代大鼠的海馬神經(jīng)發(fā)生[2-4]。上述研究結(jié)果表明產(chǎn)前不良環(huán)境可能產(chǎn)生持久影響,改變子代出生后,甚至是成年時(shí)的海馬神經(jīng)發(fā)生。手機(jī)被動(dòng)暴露成為一種重要的產(chǎn)前不良環(huán)境。探討產(chǎn)前手機(jī)暴露對(duì)子代大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響,對(duì)預(yù)測(cè)子代腦組織的功能及損傷后修復(fù)具有積極意義。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是增殖細(xì)胞的內(nèi)源性標(biāo)志分子[5],雙皮質(zhì)素(doublecortin,DCX)是海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生和新生神經(jīng)元的分子標(biāo)志物[6],這兩個(gè)指標(biāo)可以體現(xiàn)海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化。因此本研究通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)前手機(jī)暴露后子代大鼠海馬齒狀回PCNA和DCX表達(dá),從而探討不同時(shí)程產(chǎn)前手機(jī)暴露對(duì)子代大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。
兔抗鼠 PCNA多克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào) bs-2006R)、兔抗鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)多克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-4989R)、兔抗鼠β-肌動(dòng)蛋白多克隆抗體(β-actin,產(chǎn)品編號(hào)bs-0061R))、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-0295G-Bio)、生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-0294R-Bio)、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-0295G-HRP)、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗羊 IgG抗體(產(chǎn)品編號(hào) bs-0294RHRP)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、硝酸纖維素膜、電化學(xué)發(fā)光(Electro-Chemi-Luminescence,ECL)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物公司;羊抗鼠DCX多克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)sc-8066)購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司。
1.2.1 孕鼠手機(jī)射頻暴露模型 SD大鼠均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。12周齡雄性及雌性SD大鼠各18只,按1∶1隨機(jī)合籠,發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠第0天。18只孕鼠隨機(jī)分為3組:分別為短時(shí)暴露組、長(zhǎng)時(shí)暴露組和對(duì)照組(n=6),放于一個(gè)飼養(yǎng)籠內(nèi)。大鼠均可自由獲取水及食物,飼養(yǎng)溫度為22℃±1℃,光照時(shí)間為7:00 am~7:00 pm。參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行孕鼠手機(jī)射頻暴露[7]:每個(gè)實(shí)驗(yàn)籠裝有一個(gè)無(wú)聲的800~1 900 Mhz三星手機(jī)(SM-G3608,GSM網(wǎng)絡(luò),850~1 900MHz),其比吸收率(Specific Absorption Ratio,SAR)為 1.6 W/kg,放置在飼養(yǎng)瓶區(qū)域,并于籠內(nèi)放置電磁輻射監(jiān)測(cè)儀(Anritsu MS2711,Japan)測(cè)定手機(jī)輻射量,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的磁場(chǎng)強(qiáng)度為通話狀態(tài)5~18微特斯拉,待機(jī)狀態(tài)2~6微特斯拉。短時(shí)暴露組、長(zhǎng)時(shí)暴露組和對(duì)照組大鼠分別置于不同房間。從妊娠第1天至第17天,短時(shí)暴露組的手機(jī)處于每天 6 h通話狀態(tài)(8:00~12:00,14:00~16:00),長(zhǎng)時(shí)暴露組的手機(jī)處于每天24 h通話狀態(tài)(為避免手機(jī)發(fā)熱對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,由兩部手機(jī)交替進(jìn)行),對(duì)照組手機(jī)處于未使用狀態(tài)。為確保獨(dú)立于妊娠期可變化長(zhǎng)短(18~20 d)的平等暴露時(shí)間,在第17天結(jié)束,所有的手機(jī)被移除。在第18天,孕鼠被分開(kāi)放置在單獨(dú)的籠內(nèi)待產(chǎn)。孕鼠均自然分娩,記錄各組孕鼠的妊娠期長(zhǎng)短、妊娠期體重增長(zhǎng)(發(fā)現(xiàn)陰栓至妊娠第18天)、各仔鼠的出生體重,隨后每窩仔鼠隨機(jī)留6只飼養(yǎng)以避免奶水?dāng)z入不足對(duì)子代大鼠生長(zhǎng)的影響。子代大鼠滿3周后斷乳。
1.2.2 取材 子代大鼠于1月齡時(shí),每組隨機(jī)選取子代大鼠6只(每窩1只),于10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,4%多聚甲醛心臟灌注后取腦。冠狀位切取包含海馬部分的腦組織塊(腦圖譜上前囪往后約1.5~5 mm處),石蠟包埋,5μm切片。焦油紫染色:切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、焦油紫染色、酒精分化及脫水、二甲苯透明后中性樹(shù)脂封片。光鏡下觀察海馬齒狀回細(xì)胞的變化。
PCNA和DCX免疫組化:切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度酒精水化,抗原修復(fù)后加入3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,分別與兔抗鼠 PCNA一抗(1∶400)和羊抗鼠DCX一抗(1∶200)孵育,PBS沖洗后與生物素化二抗孵育,DAB顯色,中性樹(shù)脂封片。高倍顯微鏡下觀察齒狀回內(nèi)PCNA和DCX的表達(dá)情況,并使用Image Pro-plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)齒狀回顆粒細(xì)胞下層PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
1.2.3 Western blot檢測(cè) 子代大鼠于1月齡時(shí),每組隨機(jī)選取子代大鼠6只(每窩1只),于麻醉后快速斷頭取腦,分離海馬組織,液氮凍存。提取海馬組織總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量組織蛋白后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉后分別加入羊抗鼠 DCX一抗(1∶400)、BDNF一抗(1∶400)、βactin(1∶2 000),4℃過(guò)夜并于洗滌后與辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗孵育。ECL顯影后采用image j軟件系統(tǒng)分析各條帶吸光度值,并以目的條帶與β-actin的吸光度比值表示最終結(jié)果。
采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。
對(duì)照組、短時(shí)暴露組、長(zhǎng)時(shí)暴露組大鼠的孕期、妊娠期體重增長(zhǎng)和各組的胎兒數(shù)、胎兒出生體重?zé)o顯著差異(P<0.05,表 1)。
Tab.1 Length of pregnancy,maternal weight gain,litter size and pup’s body weight in three groups(±s,n=6)
Tab.1 Length of pregnancy,maternal weight gain,litter size and pup’s body weight in three groups(±s,n=6)
Group Length of pregnancy(days)Maternal weight gain(g) Litter size Pup’s body weight(g )Control 21.00±0.82 118.73±3.53 9.25±1.26 6.44±0.21 Short term exposure 21.75±0.50 121.06±2.69 9.75±1.20 6.48±0.34 Long term exposure 21.00±0.81 119.41±2.46 8.75±1.25 6.49±0.26
焦油紫染色低倍鏡下可見(jiàn)呈“V”形的齒狀回與呈“C”形的海馬相互嵌合,齒狀回主要由染色相對(duì)較深的顆粒細(xì)胞層組成,顆粒細(xì)胞層圍住的細(xì)胞區(qū)域?yàn)槎嘈渭?xì)胞層,此層細(xì)胞成分較少(圖1A-C)。高倍鏡下,對(duì)照組(圖1D)、短時(shí)暴露(圖1E)和長(zhǎng)時(shí)暴露組(圖1F)的齒狀回顆粒細(xì)胞層均可見(jiàn)緊密排列的顆粒細(xì)胞,細(xì)胞呈圓形,細(xì)胞核呈特征性的泡狀,各組顆粒細(xì)胞的大小及形態(tài)沒(méi)有明顯差異。對(duì)照組及短時(shí)暴露組的多形細(xì)胞層均可觀察到散在的錐形細(xì)胞,具有泡狀核且細(xì)胞體呈三角形(圖1D和E),而長(zhǎng)時(shí)暴露組的多形細(xì)胞層可見(jiàn)較多被空泡區(qū)域包繞的錐形細(xì)胞,部分核皺縮且深染(圖1F,圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。
Fig. 1 Representative photomicrographs of dentate gyrus in rat offspring of control group(A and D),short term maternal mobile phone exposure group(B and E)and long term maternal mobile phone exposure group(C and F)by Cresyl violet staining
海馬齒狀回PCNA陽(yáng)性細(xì)胞呈棕紅色,主要分布在顆粒細(xì)胞下層(圖2A-F)。短時(shí)暴露組(圖2B、圖2E)齒狀回顆粒細(xì)胞下層PCNA陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組(圖2A、圖2D)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而長(zhǎng)時(shí)暴露組(圖2C和F)較對(duì)照組、短時(shí)暴露組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。低倍鏡下,對(duì)照組(圖2G)和短時(shí)暴露組(圖2H)可見(jiàn)大量的DCX陽(yáng)性細(xì)胞沿著齒狀回顆粒細(xì)胞下層分布,形成明顯的棕色“V”形,而在長(zhǎng)時(shí)暴露組(圖 2I),DCX陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,所形成的棕色“V”形淡且模糊。高倍鏡下,可見(jiàn)對(duì)照組(圖2J)和短時(shí)暴露組(圖2K)的DCX陽(yáng)性細(xì)胞的胞體位于齒狀回顆粒細(xì)胞下層,部份胞位簇狀排列,突起長(zhǎng)并向顆粒細(xì)胞層延伸,部份甚至到達(dá)分子層,而在長(zhǎng)時(shí)暴露組(圖2L,圖2見(jiàn)彩圖頁(yè)×),DCX陽(yáng)性細(xì)胞的胞體同樣位于齒狀回顆粒細(xì)胞下層,但胞體排列稀疏,突起少而短。對(duì)各組海馬DCX表達(dá)進(jìn)行Western blot檢測(cè)(圖3),DCX相對(duì)表達(dá)量短時(shí)暴露組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而長(zhǎng)時(shí)暴露組的DCX表達(dá)量較對(duì)照組、短時(shí)暴露組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2,圖2,見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。
Fig. 2 Immunohistochemical expression of PCNA and DCX in dentate gyrus of rat offspring in control group(A, D, G and J), short term maternal mobile phone exposure group(B, E, H and K)and long term maternal mobile phone exposure group(C, F, I and L)
各組海馬均可檢測(cè)到BDNF表達(dá)(圖3),長(zhǎng)時(shí)暴露組的BDNF表達(dá)較對(duì)照組、短時(shí)暴露組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。短時(shí)暴露組BDNF表達(dá)雖較對(duì)照組增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Tab.2 PCNA positive cells and the expression of DCX and BDNF in the three groups(±s,n=6)
Tab.2 PCNA positive cells and the expression of DCX and BDNF in the three groups(±s,n=6)
PCNA:Proliferating cell nuclear antigen;DCX:Doublecortin;BDNF:Brain derived neurotrophic factor*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs short term exposure group
Group PCNA DCX BDNF Control 20.00±0.82 0.71±0.02 0.57±0.04 Short term exposure 21.50±1.00 0.68±0.03 0.60±0.01 Long termexposure 10.75±1.26*#0.39±0.02*#0.38±0.02*#
Fig.3 Expression of DCX and BDNF in hippocampus of rat offspring by Western blot
本研究結(jié)果表明,不同強(qiáng)度產(chǎn)前手機(jī)暴露并不影響孕鼠妊娠期體重增長(zhǎng),從而排除了產(chǎn)前手機(jī)暴露對(duì)孕鼠營(yíng)養(yǎng)的影響。此外,產(chǎn)前手機(jī)暴露并不影響孕期長(zhǎng)短、胎鼠數(shù)量和胎鼠的出生體重,這與既往的研究結(jié)果一致[8]。
海馬齒狀回是神經(jīng)發(fā)生的重要場(chǎng)所,產(chǎn)前手機(jī)暴露對(duì)子代大鼠齒狀回細(xì)胞形態(tài)的影響目前尚不明確。不同研究的結(jié)論不盡相同,有研究表明妊娠期手機(jī)暴露會(huì)引起子代大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目出現(xiàn)改變[8],而另有研究則認(rèn)為妊娠期手機(jī)暴露并不改變子代大鼠海馬齒狀回的細(xì)胞形態(tài)[10]。這些不同的結(jié)果可能與手機(jī)產(chǎn)前暴露的強(qiáng)度有關(guān)。本研究中設(shè)計(jì)了短時(shí)和長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)前手機(jī)暴露,均未發(fā)現(xiàn)子代大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞大小和形態(tài)的改變,但在長(zhǎng)時(shí)暴露組,多形細(xì)胞層的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了改變。這說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的產(chǎn)前手機(jī)暴露會(huì)引起子代大鼠齒狀回細(xì)胞形態(tài)改變。雖然在本研究中,這種細(xì)胞形態(tài)改變只出現(xiàn)在多形細(xì)胞層,但作為神經(jīng)干細(xì)胞主要分布區(qū)的顆粒細(xì)胞下層位于顆粒細(xì)胞層和多形細(xì)胞層之間,與多形細(xì)胞層緊密相鄰。推測(cè)多形細(xì)胞層的這種形態(tài)學(xué)改變可能會(huì)引起顆粒細(xì)胞下層的神經(jīng)干細(xì)胞功能改變,影響海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生。
增殖是神經(jīng)發(fā)生的初始階段。PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,與DNA復(fù)制相關(guān),在細(xì)胞周期的所有時(shí)相表達(dá),因此PCNA可作為增殖細(xì)胞的內(nèi)源性標(biāo)志分子[5]。本研究對(duì)照組和暴露組均在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層發(fā)現(xiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞,提示存在細(xì)胞增殖,但長(zhǎng)時(shí)暴露組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組和短時(shí)暴露組明顯減少,提示產(chǎn)前長(zhǎng)時(shí)程手機(jī)暴露抑制了子代大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層的細(xì)胞增殖,而產(chǎn)前短時(shí)手機(jī)暴露則對(duì)該區(qū)域細(xì)胞增殖無(wú)影響。此外還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前長(zhǎng)時(shí)手機(jī)暴露引起子代大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞下層DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少以及細(xì)胞突起改變。DCX表達(dá)被認(rèn)為是海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的分子標(biāo)志物且只表達(dá)于新生神經(jīng)元[6],DCX表達(dá)的減少提示齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞向新生神經(jīng)元的分化受到抑制。不僅如此,DCX陽(yáng)性細(xì)胞突起的改變還會(huì)影響新分化的神經(jīng)元與其他神經(jīng)細(xì)胞建立突觸聯(lián)系,從而影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成。因此,產(chǎn)前手機(jī)暴露會(huì)抑制子代大鼠海馬齒狀回的細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化,且與產(chǎn)前手機(jī)暴露的程度相關(guān)。
BDNF是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,BDNF可通過(guò)與酪氨酸激酶 B受體(tyrosine receptor kinase B,TrkB)結(jié)合,啟動(dòng)下游信號(hào)通路,如磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB)[11]和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),促進(jìn)神經(jīng)干/前體細(xì)胞的增殖和分化,在神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。已有研究表明BDNF可以在體外誘導(dǎo)人類骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[13],且敲除小鼠的BDNF基因會(huì)損害齒狀核顆粒細(xì)胞下層新生神經(jīng)元的分化和成熟,局部合成BDNF則促進(jìn)了神經(jīng)前體細(xì)胞的分化和成熟[14]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染可以通過(guò)影響B(tài)DNF及下游信號(hào)通路而改變子代大鼠的內(nèi)源性海馬神經(jīng)發(fā)生[11],這說(shuō)明產(chǎn)前不良環(huán)境可以產(chǎn)生持久的影響,改變出生后子代大鼠的BDNF而影響神經(jīng)發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)前長(zhǎng)時(shí)手機(jī)暴露組子代大鼠海馬BDNF表達(dá)較對(duì)照組和短時(shí)暴露組減少,推測(cè)產(chǎn)前長(zhǎng)時(shí)手機(jī)暴露可能通過(guò)改變子代大鼠海馬BDNF表達(dá)而影響齒狀回的神經(jīng)細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化。但是,這一過(guò)程的具體機(jī)制尚不明確,產(chǎn)前手機(jī)暴露是否會(huì)改變母體的下丘腦-垂體軸,進(jìn)而間接影響子代大鼠腦部發(fā)育,或是直接通過(guò)影響子代大鼠海馬BDNF而改變下游PI3K/PKB信號(hào)通路,最終影響神經(jīng)發(fā)生,這些都有待于今后的進(jìn)一步研究。
總之,本研究表明產(chǎn)前長(zhǎng)時(shí)手機(jī)暴露會(huì)改變子代大鼠海馬齒狀回的形態(tài)、細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化,而產(chǎn)前短時(shí)手機(jī)暴露則不會(huì)造成影響。
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中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志2018年1期