H 2S對大鼠心肌肥大與miRNA-133a和Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響*

吳 揚(yáng)，郭媛媛，張?jiān)?，?宜

（南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南通226019）

近些年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)可合成內(nèi)源性H2S，它作為一種新型的調(diào)節(jié)因子和信號傳遞分子，在神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生理調(diào)節(jié)作用，因而被稱之為繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信使分 子［1，2］。胱硫 醚-γ-裂 解 酶 （cystathionineγlyase，CSE）是心血管系統(tǒng)中生成內(nèi)源性H2S的主要合成酶［3］。近年來，H2S作為一種重要的氣體信號分子，已成為心血管疾病研究的新靶標(biāo)。研究［4，5］表明，miR-133a是心肌肥大重要的負(fù)性調(diào)控因子。CaN和 NFATc4已被證實(shí)是miR-133a的下游靶基因。H2S是否可能通過上調(diào)miR-133a表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的激活，參與調(diào)節(jié)心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程，目前尚不十分清楚。

本研究應(yīng)用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）建立心肌細(xì)胞肥大模型，觀察心肌細(xì)胞肥大時CSE／H2S體系的變化，明確內(nèi)源性H2S在心肌細(xì)胞肥大中的作用，探討H2S對心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PAG）（Sigma，USA），rabbit anti-CaN、rabbit anti-NFATc4 （CST，USA），Lipofectamine 2000、Fluo-4／AM（Invitrogen，USA），miRNA-133a antagomir、miRNA-133a-antagmir-NC（吉瑪生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 新生1～3 d SD大鼠（南通大學(xué)動物中心提供），取心臟置D-Hanks液中，將心室肌切碎約1 mm3，加入10 ml 0.125%胰酶攪拌消化。棄上清，細(xì)胞移至15%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中孵育。將細(xì)胞接種于100 mm規(guī)格的無菌培養(yǎng)皿中，于5%CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中放置2 h。孵育后，加入Brdu使其終濃度為0.1 mmol／L。臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)48 h后，換無血清DMEM培養(yǎng)基，24 h后加入干預(yù)因素［6］。

1.2.2 心肌細(xì)胞表面積測定 心肌細(xì)胞加ISO持續(xù)作用48 h后，在相差顯微鏡下拍照，每孔取10個視野，每個視野約20個細(xì)胞。采用Leica圖像分析系統(tǒng)，標(biāo)尺測量細(xì)胞表面積，取平均值。

1.2.3 心肌細(xì)胞蛋白含量測定 將6孔板貼壁培養(yǎng)的心肌細(xì)胞用胰蛋白酶處理使其脫落懸浮，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)，一個樣本的細(xì)胞數(shù)約為（8～9）×105cells。用BCA法測定心肌細(xì)胞總蛋白含量。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR 樣品總RNA提取采用TRIzol試劑盒，按說明書步驟提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄和 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)按說明書步驟進(jìn)行。BNP，β-MHC，CSE，CaN，miRNA-133a，GAPDH引物（上海生工合成）序列如下：BNP上游引物 5’-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3’，BNP下游引物 5’-CACTGTGGCAAGTTTGTGCT-3’；β-MHC上游引物 5’-AACCTGTCCAAGTTCCGCAAGGTG-3’，β-MHC下游引物 5’-GAGCTGGGTAGCACAAGAGCTACT-3’；CSE上游引物5’-TCCGATGACCTCAACGAAC-3’，CSE下游引物 5’-CGGTAGCCCAGGATAAATAA-3’；CaN上游引物 5’-CCACAGGGATGTTGCCTAGTG-3’，CaN下游引物 5’-GTCCCGTGGTTCTCAGTGGTA-3’；miRNA-133a上游引物 5’-ATGGTTCGTGGGTTTGGTCCCCTTCAACC-3’，miRNA-133a下游引物 5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH上游引物 5’-TCTACATGTTCCAGTATGA CTC-3’，GAPDH下游引物 5’-ACTCCACGACATAC TCAGCACC-3’。將配制的溶液置于 qRT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度60℃，15 s。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因的Ct值求得各樣本目的基因表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測 CaN、NFATc4蛋白的表達(dá)

提取各組心肌細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整上樣量為30μl。10%SDS-PAGE分離，PVDF膜印跡。室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（anti-CaN抗體 1∶1 000、anti-NFATc4抗體 1∶1 000、anti-GAPDH抗體 1∶5 000、anti-PCNA抗體 1∶1 000稀釋），4℃過夜，然后加入辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X光片顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，美國 UVP公司GDS8000攝取圖像，Image J分析軟件對條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.6 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染 每孔取1.25μl寡聚物稀釋至50μl Opti MEM培養(yǎng)液；取 1.5μl lipofectamine 2 000稀釋到50μl Opti MEM培養(yǎng)液，加至已稀釋的寡聚物中孵育。棄培養(yǎng)基，加入400μl Opti-MEM，加至心肌細(xì)胞中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，換正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用于檢測。用于轉(zhuǎn)染的miRNA-133a抑制劑（miRNA-133a antagomir）和 miRNA-133a抑制劑的陰性對照（miRNA-133a antagomir-NC）。

1.2.7 Elisa法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)H2S含量 將心肌細(xì)胞消化后收集，加入PBS稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度達(dá)到1×106cells／ml左右。反復(fù)凍融，使細(xì)胞破裂。4℃，2 000～3 000 r／min離心20 min，收集上清。BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，然后進(jìn)行心肌細(xì)胞內(nèi)H2S含量測定。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細(xì)胞鈣離子濃度 心肌細(xì)胞加入 1 ml PBS（含 5μl Fluo-4／AM），37℃培養(yǎng)箱中避光染色30 min。用PBS洗去熒光染料，將培養(yǎng)板置激光共聚焦顯微鏡下，對心肌細(xì)胞進(jìn)行掃描，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。將測取的鈣熒光圖像存入計(jì)算機(jī)，熒光強(qiáng)度值由Leica激光共聚焦顯微鏡自帶軟件Fluoview自動分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 H2S對心肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)控作用

在用 10μmol／L ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大前30 min，分別應(yīng)用100μmol／L NaHS增加細(xì)胞內(nèi) H2S含量，或應(yīng)用2 mmol／L PAG降低細(xì)胞內(nèi)H2S含量，觀察對心肌細(xì)胞肥大的影響。實(shí)驗(yàn)分組：（1）對照組、（2）ISO組、（3）NaHS組、（4）NaHS+ISO組、（5）PAG組、（6）PAG+ISO組。結(jié)果顯示：與對照組相比，ISO組或PAG組CSE mRNA表達(dá)均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與ISO組比較，NaHS+ISO組CSEmRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01），PAG+ISO組則進(jìn)一步降低（P＜0.05）。NaHS組與對照組相比，無明顯差異（圖 1A）。

與對照組相比，ISO組心肌細(xì)胞內(nèi)H2S含量降低（P＜0.01），NaHS組 H2S含量增加（P＜0.01），PAG組細(xì)胞內(nèi)H2S含量降低（P＜0.01）。與ISO組相比，NaHS+ISO組 H2S含量增加（P＜0.01），而PAG+ISO組則進(jìn)一步降低（P＜0.01，圖 1B）。

Fig.1 Effects of NaHSand PAGon the level of CSE／H2Sin the ISO-induced cardiomyotytes hypertrophy（±s，n＝4）

與對照組相比，ISO組心肌細(xì)胞表面積、蛋白含量、BNP和β-MHC mRNA表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。NaHS+ISO組與ISO組相比，心肌細(xì)胞表面積、蛋白含量、BNP和β-MHCmRNA表達(dá)均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。PAG+ISO組與 ISO組相比，心肌細(xì)胞表面積、蛋白含量、β-MHC和BNPmRNA表達(dá)水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS或 PAG組與對照組相比，均未見明顯差異（圖2）。

Fig.2 Effects of negative regulation of H2Son cardiomyocyte hypertrophy（±s，n＝4）

2.2 H2S對心肌細(xì)胞肥大抑制作用與miRNA-133a及Ca2+／CaN／NFATc4通路的關(guān)系

2.2.1 上調(diào)或下調(diào) H2S含量對心肌細(xì)胞 miRNA-133a及Ca2+／CaN／NFATc4通路的影響 分別應(yīng)用NaHS或PAG上調(diào)或下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)H2S含量，觀察對心肌細(xì)胞 miR-133a及 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路相關(guān)因子的影響。實(shí)驗(yàn)分組同前。結(jié)果顯示：與對照組相比，ISO組miR-133a mRNA表達(dá)降低、心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加、CaN mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加、NFATc4核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)、NFATc4胞漿蛋白表達(dá)減少而核蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS預(yù)處理組明顯逆轉(zhuǎn)ISO引起的上述效應(yīng)。相反，PAG預(yù)處理組則進(jìn)一步增強(qiáng)ISO引起的上述效應(yīng)（圖 3）。

Fig.3 Effects of NaHSor PAG on the miRNA-133a and Ca2+／CaN／NFATc4 pathway in the ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy（±s，n＝4）

2.2.2 Antagomir-133a干擾對 H2S抑制心肌細(xì)胞肥大及miRNA-133a介導(dǎo)的 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響 應(yīng)用miRNA-133a抑制劑antagomir-133a干擾，觀察對心肌細(xì)胞肥大及Ca2+／CaN／NFATc4通路的影響。首先，檢測應(yīng)用lipofectamine 2 000將antagomir-133a轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，將antagomir-133a轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可顯著降低miRNA-133a的表達(dá)水平，其干擾率達(dá)95%以上，表明轉(zhuǎn)染效果很好。實(shí)驗(yàn)分組：（1）對照組，（2）ISO組，（3）NaHS組，（4）NaHS+ISO組，（5）antagomir-133a+NaHS+ISO組，（6）NC+NaHS+ISO組。

結(jié)果顯示，與 NC+NaHS+ISO組相比，antagomir-133a+NaHS+ISO組心肌細(xì)胞表面積、蛋白含量、BNP和β-MHC mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。NaHS+ISO組與NC+NaHS+ISO組相比，差異無顯著性（圖 4A、4B、4C、4D）。

與對照組相比，ISO組miRNA-133a mRNA表達(dá)降低、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加、CaN mRNA和蛋白表達(dá)均增加、NFATc4核轉(zhuǎn)位明顯增強(qiáng)、NFATc4胞漿蛋白表達(dá)減少而胞核蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）。與ISO組相比，NaHS+ISO組miR-133a mRNA表達(dá)升高、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯減少、CaN mRNA和蛋白表達(dá)均降低、NFATc4核轉(zhuǎn)位減弱、NFATc4胞漿蛋白表達(dá)增加而胞核蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）；與NC+NaHS+ISO組相比，antagomir-133a+NaHS+ISO組miRNA-133a表達(dá)降低、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有所增加、CaN mRNA和蛋白表達(dá)增加、NFATc4核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)、NFATc4胞漿蛋白表達(dá)減少而胞核蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS+ISO組與 NC+NaHS+ISO組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 4E、4F、4G、4H、4I）。

Fig.4 Effects of antagomir-133a interference on cardiomyocyte hypertrophy and miR-133a-mediated Ca2+／CaN／NFATc4 signal pathway（±s，n＝4）

3 討論

本課題組以往的實(shí)驗(yàn)表明［7］，應(yīng)用 10μmol／L ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，可引起心肌細(xì)胞肥大的主要指標(biāo)，即心肌細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面積均明顯增大，細(xì)胞蛋白含量、以及心肌肥大標(biāo)志基因BNP、β-MHC mRNA表達(dá)均增高，表明應(yīng)用ISO能夠成功構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型。

為了探討H2S在心肌肥大中的作用，本研究應(yīng)用ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，觀察心肌細(xì)胞內(nèi)CSE／H2S表達(dá)變化。結(jié)果表明，ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，CSE／H2S水平明顯下降。此外，應(yīng)用 H2S供體NaHS上調(diào)細(xì)胞內(nèi)H2S含量，或應(yīng)用CSE特異性抑制劑PAG降低細(xì)胞內(nèi)H2S含量，觀察對心肌細(xì)胞肥大的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaHS預(yù)處理能明顯抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積、蛋白含量以及 BNP、β-MHC mRNA表達(dá)水平的增加，提示NaHS能夠抑制心肌細(xì)胞肥大。相反，應(yīng)用PAG預(yù)處理減少內(nèi)源性H2S生成，則增強(qiáng)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng)。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中是一個中心環(huán)節(jié)。有文獻(xiàn)報道［8］，過表達(dá) CaN或 NFATc4的轉(zhuǎn)基因小鼠出生后可出現(xiàn)與人類心肌肥大相似的病理變化，提示心肌細(xì)胞內(nèi)可能存在一條致心肌肥大的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即CaN／NFATc4信號通路。CaN是一種受Ca2+調(diào)控的絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶。在細(xì)胞信號傳遞的過程中，CaN被Ca2+激活后使胞漿中靶蛋白NFATc4脫磷酸化后入核，繼而和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GATA4相互作用，激活心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。已有研究［4］證實(shí)，CaN是miR-133的下游靶基因。當(dāng)心肌肥大時，miR-133表達(dá)降低、CaN的表達(dá)增加且活性增強(qiáng)；而當(dāng)上調(diào)miR-133的表達(dá)或抑制CaN的表達(dá)則能夠?qū)剐募》蚀?。綜上分析，我們推測H2S抑制心肌肥大作用可能與 miR-133a介導(dǎo)的 Ca2+／CaN／NFATc4通路相關(guān)。為了驗(yàn)證兩者的關(guān)系，本研究分別應(yīng)用NaHS或PAG預(yù)處理增加或減少心肌細(xì)胞內(nèi)H2S的水平，觀察對心肌細(xì)胞中 miR-133a表達(dá)、以及對 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISO刺激能使心肌細(xì)胞miR-133a表達(dá)降低、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加、CaN mRNA及蛋白表達(dá)增加、NFATc4核蛋白表達(dá)增加及核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)。應(yīng)用NaHS增加細(xì)胞內(nèi)H2S水平，可明顯抑制ISO誘導(dǎo)的上述效應(yīng)；而應(yīng)用PAG減少心肌細(xì)胞內(nèi)H2S的生成，則明顯增強(qiáng)ISO誘導(dǎo)的肥大作用。

為了進(jìn)一步探討H2S抑制心肌細(xì)胞肥大作用與miR-133a介導(dǎo)的 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用miR-133a抑制劑antagomir-133a干擾ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，觀察對心肌細(xì)胞肥大及Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，antagomir-133a能進(jìn)一步加強(qiáng)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大效應(yīng)，并增加ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、CaN mRNA和蛋白表達(dá)及NFATc4胞核蛋白表達(dá)、增強(qiáng)NFATc4核轉(zhuǎn)位。此外，antagomir-133a還能部分逆轉(zhuǎn)H2S抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

綜上所述，H2S可通過負(fù)性調(diào)控作用抑制心肌細(xì)胞肥大。心肌細(xì)胞肥大發(fā)生可能與CSE／H2S體系功能降低，內(nèi)源性H2S合成減少有關(guān)。H2S負(fù)性調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的作用可能與H2S上調(diào)miRNA-133a的表達(dá)，抑制其下游 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的激活有關(guān)。本研究進(jìn)一步闡明H2S對心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用及其機(jī)制，將有助于全面了解心肌肥大的病理機(jī)制，并為該疾病的防治提供新的思路和理論依據(jù)。

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