分子育種技術(shù)及其在豬育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

丁麗艷 何寶國 宋斌 韓永勝 李同豹 丁昕穎 李平

摘要：隨著分子遺傳學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子數(shù)量遺傳學(xué)也得到了相應(yīng)的發(fā)展，這為動物分子育種技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)與保障。與傳統(tǒng)的育種方法相比，動物分子育種是直接在分子水平上對性狀的基因進(jìn)行選擇，選種的準(zhǔn)確性更高?，F(xiàn)綜述動物分子育種及其在豬育種中應(yīng)用進(jìn)展，為豬分子育種技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：豬；分子育種；基因；應(yīng)用

中圖分類號：S81

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-9737（2018）01-0001-03

自20世紀(jì)80年代以來，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)和信息技術(shù)的迅速發(fā)展，動物分子遺傳學(xué)和動物基因組計劃的研究取得了大量的突破性進(jìn)展，動物育種技術(shù)已逐漸從群體水平進(jìn)入分子水平，從傳統(tǒng)育種方法向著快速改變動物基因型方向發(fā)展。隨著動物分子育種理論基礎(chǔ)不斷完善，應(yīng)用技術(shù)不斷成熟，各種現(xiàn)代生物技術(shù)的綜合應(yīng)用，動物（尤其是豬）育種進(jìn)程得到了飛速的發(fā)展。

1 動物分子育種的概念

動物分子育種即利用數(shù)量遺傳學(xué)理論和分子診斷技術(shù)來改良動物品種的新型學(xué)科，是以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，遺傳學(xué)為依據(jù)，在DNA分子水平上對家畜品種進(jìn)行改良，包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)、克隆技術(shù)、胚胎生物技術(shù)和分子遺傳標(biāo)記，分子育種技術(shù)加快了動物育種速度，改良了動物品種。

由于分子育種是直接在分子水平上對性狀基因進(jìn)行選擇，準(zhǔn)確性大大提高的同時，也克服了傳統(tǒng)育種方法的缺陷。動物分子育種包括兩方面內(nèi)容：一是基因組育種，即在動物重要經(jīng)濟(jì)性狀基因型分析基礎(chǔ)上，通過分子標(biāo)記技術(shù)對動物數(shù)量性狀基因進(jìn)行直接選擇，或者通過標(biāo)記輔助導(dǎo)入有利基因或清除不利基因等，建立在基因組變異圖譜基礎(chǔ)上的全基因組關(guān)聯(lián)分析，以達(dá)到更有效地改良動物的目的；二是轉(zhuǎn)基因育種，即通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源基因?qū)肽撤N動物的基因組上，達(dá)到改良重要生長性狀或非常規(guī)育種性狀，育成轉(zhuǎn)基因動物新品種（系）的目的。

2 分子育種技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

2.1 生長發(fā)育相關(guān)性狀基因的分子診斷

豬生長發(fā)育相關(guān)的候選基因研究主要涉及初生重、生長速度以及日增重等，主要包含有IGF2、MC4R、MSTN、MyoG、pGH、Ob、FUT1等基因。

IGF2是一種胰島素樣生長因子，它能促進(jìn)脂肪沉積，提高豬背膘厚度，對豬的生長發(fā)育、瘦肉率等有一定影響。VanLaere等在IGF2內(nèi)含子3的3072位點上發(fā)現(xiàn)一個G突變?yōu)锳，突變個體瘦肉率和肌肉重量都比野生型個體高。MC4R也是一種影響豬生長育肥性狀的主效基因，主要為突變型和雜合型，而高脂肪含量的梅山豬幾乎全部為野生型，MC4R突變基因型梅山豬會增加背膘厚，而且在不同品種豬中分布也不同，其中中國地方豬種中呈高頻分布，且GG基因型個體的胸、腰、臀部膘厚較AA基因型和AG基因型個體厚。宋成義等利用PCR-RFLPs技術(shù)，研究了GH基因部分突變位點對姜曲海豬生產(chǎn)性能的影響，發(fā)現(xiàn)其GH基因Apal酶切突變位點G4G4基因型個體0～70日齡日增重和70日齡豬的體重都極顯著高于G3G3/G3G4基因型個體?？茁奋姷葘嶒灠l(fā)現(xiàn)，瘦肉型豬血清中Ob基因含量顯著高于脂肪型豬，Ob基因mRNA表達(dá)含量和kptin濃度呈高度正相關(guān)，兩者與初產(chǎn)母豬血清FSH、LH和總產(chǎn)仔數(shù)成正相關(guān)，與初生個體重呈負(fù)相關(guān)。趙曉楓等對金華豬IGF15調(diào)控序列微衛(wèi)星座位研究發(fā)現(xiàn)274bp和286bp等位基因有利于提高初生重，280bp的等位基因有利于第二胎出生窩重的提高。姜勛平等用PCR - RFLP方法檢測139頭雜交豬FUT1基因型間肉質(zhì)和胴體性狀差異，發(fā)現(xiàn)AA基因型豬3個部位肌肉pH值均比AG基因型的高，肌肉系水力、肉色值、瘦肉率顯著高于AG豬（P

2.2 繁殖性狀相關(guān)基因的診斷

豬繁殖性狀相關(guān)候選基因的研究主要涉及母豬乳頭數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)等，相關(guān)的候選基因研究取得了較大進(jìn)展，主要有ESR、FSHβ、OPN、RBP4、PRLR、RARG、NCOA1、MTNRIA、GnRH、GnRHR、LH、LHR、FSHR等基因。

趙西彪等利用PCR - RFLP方法對144頭大約克夏母豬的ESR和FSHp基因進(jìn)行檢測，分析結(jié)果ESR和FSHp基因?qū)Υ蠹s克夏母豬乳頭數(shù)都有顯著影響，且BB型母豬乳頭數(shù)高于AB型和AA型。柳淑芳等對萊蕪豬FSHp基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，通過測序發(fā)現(xiàn)FSHβ基因在萊蕪豬種中與控制豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因緊密連鎖，AA型基因母豬平均每胎比BB基因型母豬多產(chǎn)仔1.2頭。李永輝對大白、長白和杜洛克豬NCOA1基因與產(chǎn)仔性狀的相關(guān)及序列分析，發(fā)現(xiàn)NCOA1基因?qū)Ξa(chǎn)仔性狀有顯著影響，AA型個體產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)都顯著高于BB型個體。Rothschild等對6個商品系母豬所產(chǎn)的仔豬進(jìn)行RBP4基因檢測，發(fā)現(xiàn)AA基因型與BB基因型相比，總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)都高，這表明RBP4基因影響著豬的繁殖性能。Putnova等在豬PRLR第8外顯子到第10外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個HpaⅡ酶切多太位點，且該多太位點顯著影響總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)。

2.3 肉質(zhì)性狀相關(guān)基因的診斷

隨著生活水平的提高，人們對肉品質(zhì)的要求越來越高，對肉品質(zhì)性狀的基因鑒別和定位成為豬育種工作中的一個重點。肉質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，主要衡量指標(biāo)有肉色、pH、嫩度、風(fēng)味、多汁性、系水力、大理石花紋等，與肉品質(zhì)相關(guān)的基因主要有：RYR1、RN、A- FABP、H FABP、MyoD、CaMK、CAST、CAPN等。

發(fā)生應(yīng)激綜合癥的豬其肉質(zhì)蒼白、松軟，切面滲水，稱為PSE肉。實驗用氟烷麻醉劑可誘導(dǎo)豬應(yīng)激綜合癥的發(fā)生，對氟烷敏感性狀是由一對等位基因Hal控制，HalNH alN個體抗應(yīng)激能力較強(qiáng)，HalnH aln個體應(yīng)激較敏感，研究者們對國內(nèi)外豬種進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)，皮特蘭豬、比利時系長白豬中n基因頻率較高，而杜洛克、約克夏和漢普夏豬中n基因頻率較低，屬于應(yīng)激抵抗品種。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)PSE肉是由于發(fā)生應(yīng)激綜合癥的豬個體尼啶受體基因（ RYRl）突變引起的，但RYR1突變引起肌纖維持續(xù)收縮，同時也能刺激肌細(xì)胞的伸長和變粗，顯著地提高胴體瘦肉率，相對于正常豬，其肌肉更發(fā)達(dá)。酸肉基因RN可使肌糖原含量升高，豬肉系水力降低，肌肉pH值低，是一個顯性遺傳基因。RN在漢普夏豬或含有漢普夏豬血統(tǒng)的品種中具有較高的基因頻率，在其他豬種中頻率較低。孫博興等將常規(guī)選擇指數(shù)法與應(yīng)激敏感基因型選擇法相結(jié)合，應(yīng)用于軍牧l號白豬四、五世代核心群的選種中，使應(yīng)激敏感基因頻率下降了12%。

肌內(nèi)脂肪存在于肌纖維和肌束之間，影響著肉質(zhì)的嫩度、多汁性和風(fēng)味，而A- FABP和H- FABP是肌內(nèi)脂肪含量的兩個重要的候選基因。Gerbens等利用嚙齒動物雜交系將豬A- BABP和H- FABP先后定位在6號染色體上和4號染色體上，又發(fā)現(xiàn)杜洛克豬A- FABP第1內(nèi)含子中的微衛(wèi)星多太性與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)，H - FABP多態(tài)性對杜洛克豬和梅山豬肌內(nèi)脂肪含量影響顯著。李長龍等也發(fā)現(xiàn)H - FABP、MCAR、ADD1三個基因的多態(tài)性分布在梅山豬、蘇太豬間存在極顯著差異；曲亮等研究HFABP、HSL基因在蘇淮豬中的多態(tài)性分布，結(jié)果H- FABPHinfl位點HH基因型個體的背膘厚極顯著低于hh基因型個體，而瘦肉率卻極顯著高于hh型個體。HSL基因GG基因型個體的背膘厚極顯著低于AA基因型個體，而GG基因型個體的瘦肉率為59.89%，極顯著高于AA型個體。

研究者們還發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶（CAPN）和鈣蛋白酶抑制蛋白（ CAST）組成鈣蛋白酶蛋白水解系統(tǒng)，在肉的嫩化過程中起著關(guān)鍵的作用。Rettenberger等將CAST基因定位于豬的2號染色體，而Ernst等在豬的2號染色體發(fā)現(xiàn)5個與CAST連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，并將其定位在2q2. 1- q2.4，用于肉質(zhì)候選基因進(jìn)行育種。程豐等對新榮昌I系豬的CAST基因多態(tài)分析，首次發(fā)現(xiàn)的CAST/Msp I酶切位點中DD基因型與肌脂含量IMP（%）存在顯著正相關(guān)；CASTRsal酶切位點中EF基因型與失水率LMR（%）存在顯著負(fù)相關(guān)。朱礪等分析了MyoD基因在不同品種豬中的分布情況，結(jié)果表明在多數(shù)地方豬種群體中C基因的分布具有絕對優(yōu)勢，且主要以雜合子AC形式存在。突變型A基因?qū)﹄伢w性狀和胴體等級性狀的影響較大，可極顯著地增加胴體瘦肉率和眼肌面積，降低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴體長度，同時會降低豬肉品質(zhì)。

2.4 毛色基因的分子診斷

毛色與血型、生化和分子標(biāo)記都是一種可利用的遺傳標(biāo)記，應(yīng)用毛色可以評判豬品種的純度、親緣關(guān)系、遺傳穩(wěn)定性等，所以根據(jù)毛色遺傳規(guī)律能夠進(jìn)行雜交育種，同時為了滿足市場的需求，可以對豬的毛色進(jìn)行選育。

豬的毛色遺傳受多個基因座控制，包括A（野灰色位點）、E（毛色擴(kuò)展基因位點）、B（褐色位點）、C（白化位點）、D（淡化位點）、I（顯性白色位點）、Be（白肩帶位點）、He（白頭或海福特位點）和S（花斑位點）。黑素皮質(zhì)激素受體（MCIR）基因位于E座位上，并定位于6號染色體的短臂末端，MCIR由948bp的單一外顯子構(gòu)成；Kijas等分析7個豬品種的MCIR編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)，豬MCIR共有4個變異體，對應(yīng)5種不同的E等位基因，不同的等位基因?qū)?yīng)不同的突變體，且在不同的品種豬中表達(dá)，表現(xiàn)出不同的毛色。鄧素華等也對16個全同胞家系和6個中國地方豬研究發(fā)現(xiàn)，我國地方豬種在MCIR位點攜帶高頻率的顯性黑等位基因EDI。

KIT基因位于I座位，調(diào)控著豬的顯性白色毛的形成，定位于豬的8號染色體短臂1.2區(qū)，I位點對毛色擴(kuò)展基因E位點呈上位效應(yīng)，同時對野公豬和大白母豬雜交家系個體的KIT基因分析中發(fā)現(xiàn)有色毛表型僅含有片段KIT1，而顯性白毛色和斑點表型的個體中含有KIT1和KIT2。Marklund等發(fā)現(xiàn)KIT基因的2892bp的編碼序列有3個等位基因，I對應(yīng)完全顯性白毛色，等位基因IP則表現(xiàn)出白色有黑斑，在皮特蘭豬中發(fā)現(xiàn)有KIT重復(fù)和IP，KIT重復(fù)引起的不同表型是由于KIT重復(fù)序列上游外顯子150kb處調(diào)節(jié)因子缺失所致。

2.5 抗病性相關(guān)基因的診斷

豬病的預(yù)防和治療每年都會給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且隨著病原微生物耐藥性的不斷增強(qiáng)，對于豬抗病性狀的選育也成為研究的重點。主要有受體類基因、免疫類基因、信號傳導(dǎo)類基因，包括ETECF4、ETEC F18、RYR1、FUT1、BPI、NRAMP1、Mxl、MHC、TLR等基因。

在豬的疾病研究中，仔豬的腹瀉是最常見的疾病，其中由腸毒素大腸桿菌（ETEC）引起的仔豬黃痢、白痢、豬水腫疾病的發(fā)病率最高，達(dá)56. 2%以上，死亡率接近半數(shù)。ETEC分為多種抗原型，其中危害最大的是ETEC F4和ETEC F18兩種。研究表明，仔豬體內(nèi)缺乏ETEC F4和ETEC F18受體，就會對相應(yīng)的抗原類型大腸桿菌引進(jìn)的腹瀉產(chǎn)生抗性。Vogeli等對E.collF18受體基因研究發(fā)現(xiàn)，該受體的表達(dá)由等位基因顯性控制，并與控制豬血型的S基因及控制應(yīng)激敏感基因RYR1連鎖，應(yīng)激敏感性越低的豬群表達(dá)F18受體的概率越高，且對F18受體易感性與對應(yīng)激抵抗力呈正相關(guān)。

Meijerink等對α-l，2巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1（FUTl）多態(tài)性研究表明，此基因可以作為E.coli F18受體候選基因。豬FUT1的307位點G突變?yōu)锳，使得蘇氨酸代替了丙氨酸，造成了紅細(xì)胞酶系統(tǒng)改變，導(dǎo)致豬對F18黏附性和敏感性。晏學(xué)明等以杜洛克、長白、大白、漢普夏和皮特蘭5個豬種為研究對象，結(jié)果FUTI基因存在多態(tài)性，長白豬與大白豬抗性基因AA型頻率差異極顯著。袁樹楷首次克隆得到了榮昌豬BPI基因全長cDNA序列，并在榮昌豬BPI基因外顯子3區(qū)段檢測到一個新的SNP位點，發(fā)現(xiàn)第397位的G突變成A可能對榮呂豬BPI蛋白功能及機(jī)體天然免疫力有重要影響。

豬應(yīng)激綜合癥是由RYR1基因控制的一種隱性遺傳病。分子檢測發(fā)現(xiàn)，DNA上第1843bp由C突變成T，導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶酶切位點變化，當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時，Ca2+大量非正常釋放出來，引進(jìn)隱性純合子HalnH aln大量表達(dá)，發(fā)生肌肉持續(xù)收縮，產(chǎn)生灰白水樣肉（PSE），因而可以通過酶切圖譜鑒別RYR1基因，這對生產(chǎn)上消除RYR1基因影響意義較大。以天然抗性相關(guān)的巨噬蛋白基因（ NRAMPl）作為豬抗病力候選基因的研究中，發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因有5個多態(tài)性位點，NRAMP1蛋白可抵抗分枝桿菌、沙門氏菌等多種胞內(nèi)寄生病原菌的侵蝕，對畜禽機(jī)體抗病力影響較大，且在不同的豬品種中NRAMP1等位基因頻率差異較大，A等位基因只存在于白色母系中，而C等位基因只在有色的公豬中表達(dá)。

3 結(jié)語

雖然分子育種技術(shù)應(yīng)用于豬育種中，在豬的生長發(fā)育、繁殖和抗病性方面取得了一系列可喜的成果，但是分子育種的研究還不夠完善，許多功能基因的研究只限于某一片段，缺乏對全基因序列的研究，且不能作為獨立的育種技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用，在今后的研究中，相信隨著分子生物技術(shù)的不斷提高，研究的不斷深入，分子育種技術(shù)基礎(chǔ)將會越來越完善，應(yīng)用條件日臻成熟，分子育種技術(shù)在動物育種中會廣泛應(yīng)用，必將成為動物培育和改良的重要手段，并在動物保種和利用資源進(jìn)行育種中發(fā)揮重要作用。