PCV2 LAMP現(xiàn)場(chǎng)可視化定性和熒光定量PCR快速檢測(cè)試劑盒

2017年3月22日，上海市政府在上海展覽中心隆重舉辦了上海市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)大會(huì)，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所趙凱研究員主持的《斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征防控新技術(shù)的建立及應(yīng)用》項(xiàng)目榮獲2016年上海市科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)。

1 項(xiàng)目所屬科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域

屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

2 主要技術(shù)內(nèi)容

2.1 豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）是由豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的一種重要疾病，嚴(yán)重發(fā)病地區(qū)死淘率達(dá)40%以上。由于PCV2嚴(yán)重破壞豬的免疫系統(tǒng)，使各種疫苗免疫失敗。因此，PCV2感染的早期診斷和病豬的淘汰成為PMWS防治的重點(diǎn)。

2.2 PMWS防控新策略和支撐技術(shù)的建立

有鑒于此，申請(qǐng)人提出了PMWS防控新 策略：

（1）首先養(yǎng)殖戶用PCV2 LAMP試劑盒定性檢測(cè)豬群，將被PCV2感染的豬與健康豬隔離開來，防止交叉感染。

（2）用定量PCR試劑盒對(duì)被PCV2感染的豬進(jìn)行定量檢測(cè)，文獻(xiàn)報(bào)道豬體內(nèi)PCV2病毒超過4 000拷貝/mL血液就會(huì)患病，而患病豬很難康復(fù)，因此，建議將PCV2病毒超過4 000拷貝/mL血液的豬直接淘汰。

（3）母豬會(huì)將PCV2傳播給仔豬，公豬會(huì)將PCV2傳播給母豬，因此養(yǎng)殖戶用PCV2 LAMP試劑盒定性檢測(cè)種豬，將被PCV2感染的種豬直接淘汰。因此，通過以上兩種方法組合起來進(jìn)行檢測(cè)、隔離和對(duì)病豬的適當(dāng)淘汰可以防控PMWS，最大限度減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失。

為此我們建立了PCV2 LAMP現(xiàn)場(chǎng)可視化定性和熒光定量PCR快速檢測(cè)支撐技術(shù)并成功開發(fā)出試劑盒。將兩種試劑盒組合起來防控PMWS，最大限度減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失。

3 成果科技創(chuàng)新程度

（1）PCV2 LAMP現(xiàn)場(chǎng)可視化快速定性檢測(cè)試劑盒：

a 設(shè)計(jì)的PCV2 LAMP引物序列未見報(bào)道；

b 增加了一對(duì)環(huán)引物，可使LAMP反應(yīng)時(shí)間減少一半，這是前人工作所沒有的；

c 在LAMP反應(yīng)體系中添加了甜菜堿，加速了解鏈速度，這是前人工作所沒有的；

d 首創(chuàng)了不提取PCV2病毒核酸、直接以豬血清樣本為模板加入反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP反應(yīng)，減少了操作時(shí)間和步驟，降低成本。

（2）PCV2熒光定量PCR定量檢測(cè)試劑盒：

a 設(shè)計(jì)的熒光定量PCR引物和探針序列未見報(bào)道；

b 創(chuàng)造和優(yōu)化了PCV2熒光定量PCR反應(yīng)體系和參數(shù)，效果大大優(yōu)于前人的報(bào)道；

c 該方法被美國(guó)佐治亞疾控中心所采用。

（3）首次提出了將基于LAMP現(xiàn)場(chǎng)可視化快速定性檢測(cè)方法和熒光定量PCR定量檢測(cè)方法組合起來進(jìn)行豬PCV2定性、定量檢測(cè)以防控PMWS的檢測(cè)策略和技術(shù)。

（4）檢測(cè)靈敏度達(dá)到進(jìn)出口畜產(chǎn)品檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。無論在技術(shù)水平，還是試劑盒的靈敏度上，均高于國(guó)內(nèi)外同類研究。

4 知識(shí)產(chǎn)權(quán)及應(yīng)用推廣情況

申請(qǐng)專利3項(xiàng)，獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利1項(xiàng)，提出PMWS防控新策略一種，開發(fā)試劑盒2種。

在江、浙、滬、皖、魯、豫養(yǎng)豬場(chǎng)將這一新策略和技術(shù)進(jìn)行了示范推廣，用于PMWS防控。使PMWS發(fā)病率大大降低。由于利用此技術(shù)減少了藥物和飼料及人工成本，每頭豬節(jié)約30元。累積節(jié)約10.5億元養(yǎng)殖投入。采用此技術(shù)全國(guó)每年將節(jié)約180億元的養(yǎng)殖成本。