哈茨木霉菌毒素與世高對(duì)桑葚核地杖菌抑菌活性的生物測(cè)定

余丹 黃宇 黃振

摘 要 核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）是桑葚白果病的主要病原菌之一，為害桑葚引起“白果病”。本文研究了哈茨木霉菌與世高單劑及混合物防治核地杖菌的潛力。研究結(jié)果表明：哈茨木霉的乙醇提取物（毒素）對(duì)核地杖菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率分別為70%和80%以上，在室內(nèi)條件下哈茨木霉毒素與世高對(duì)核地杖菌菌絲生長(zhǎng)抑制的EC50分別為5.97、19.73 μg/mL。哈茨木霉與世高混合物對(duì)核地杖菌的抑制效果與混合物中兩種單劑的含量有關(guān)，混合物T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） 和 T6（6.0+14.0）處理組對(duì)核地杖菌的抑制效果表現(xiàn)為增效作用；從對(duì)病原菌的抑制效果、使用成本與化學(xué)農(nóng)藥使用量等方面考慮，混合物T5是用于防治核地杖菌的最佳組合。本研究結(jié)果可為使用哈茨木霉毒素及其與世高聯(lián)合防治桑葚白果病提供參考。

關(guān)鍵詞 哈茨木霉；核地杖菌；世高；生物測(cè)定；孢子萌發(fā)抑制；菌絲生長(zhǎng)抑制

中圖分類(lèi)號(hào) S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Scleromitrula shiraiana is one of the fungal pathogen that attacks mulberry fruits and causes disease named as “popcorn disease”. Trichoderma harzianum was evaluated for its efficiency to suppress plant pathogen S. shiraiana alone or combined with fungicide difenoconazole under laboratory conditions. The results showed that the ethanol extracts of T. harzianum caused high mycelial growth inhibition and germination inhibition of S. shiraiana， with the inhibition value up to 70% and 80%， respectively. The EC50 of the ethanol extracts of T. harzianum or difenoconazole in mycelial growth inhibition of S. shiraiana was 5.97 μg/mL or 19.73 μg/mL under laboratory condition， respectiviely. The level of synergism between the ethanol extract and difenoconazole was affected by the concentration of each component in the mixtures. The synergistic effects were observed in treatments T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） and T6（6.0+14.0）， respectively. The treatment T5（6.0+7.0） was determined as the best additive effects according to the inhibition， Me and Chi-square values， also the cost and reduce use of fungicides. The current research on the joint action of the ethanol extracts from T. harzianum with difenoconazole offered a promising， safe and effective alternative to fungicides in treatment against S. shiraiana， popcorn disease of mulberry.

Key words Trichoderma harzianum； Scleromitrula shiraiana； difenoconazole； bioassay； mycelial growth inhibition； germination inhibition

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.024

桑椹白果病是桑椹菌核病的俗稱(chēng)，又稱(chēng)桑白果病，屬真菌類(lèi)病害，是桑果上的主要病害，其病原菌主要有6種：桑實(shí)杯盤(pán)菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤(pán)菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）、核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）、聚杯盤(pán)菌（Synciboria ningpoensis）、茜草生核地杖菌（Scleromitrula rubicola）[1-5]。核地杖菌等白果病病原菌主要侵染桑樹(shù)的花，或在葉片的表面存活一段時(shí)間，但極少能侵染桑樹(shù)的葉片和

莖[3-4]。白果病病原菌的孢子附著到桑椹的花器上，隨后萌發(fā)、侵入子房?jī)?nèi)，入侵的菌絲在未成熟的桑果中迅速生長(zhǎng)、大量增殖，最后菌絲在桑果中形成菌核，導(dǎo)致桑果呈白色、俗稱(chēng)“白果”。桑椹白果病在世界各地均有分布，我國(guó)的廣東、浙江、江蘇、安徽、上海、陜西等地均有該病發(fā)生為害的報(bào)道[1-2]。桑椹白果病輕則影響桑葚的產(chǎn)量與品質(zhì)，重則致使桑果無(wú)法正常成熟收獲，導(dǎo)致桑葚大面積減產(chǎn)，甚至顆粒無(wú)收，帶病菌和農(nóng)藥殘留的桑葉又嚴(yán)重威脅蠶繭的生產(chǎn)，直接影響桑椹加工產(chǎn)業(yè)與蠶業(yè)生產(chǎn)所需的原料來(lái)源，威脅到桑果產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。桑椹白果病的防治目前主要采用農(nóng)業(yè)綜合防治和化學(xué)防治。國(guó)內(nèi)外多年的田間實(shí)踐表明，化學(xué)農(nóng)藥不能持續(xù)有效地控制白果病的大面積爆發(fā)危害[6-7]，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致蠶桑產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留。開(kāi)展桑椹白果病的生物防治有利于保護(hù)蠶桑產(chǎn)業(yè)的原料和產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境，采用以微生物源農(nóng)藥等為主的生物防治措施能持續(xù)、有效地控制白果病的發(fā)生為害。

木霉菌（Trichoderma sp.）廣泛存在于不同類(lèi)型的土壤中，是一種重要的植物病原生防真菌，其中哈茨木霉菌（T. harzianum）是白絹病、立枯病、疫病等多種植物病原菌的寄生菌和拮抗菌[8-9]。哈茨木霉菌主要通過(guò)重寄生作用、抗生作用、營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種方式來(lái)抑制植物病原真菌的為害[9-11]。哈茨木霉分泌的次生代謝產(chǎn)物可通過(guò)有效地破壞病原菌的細(xì)胞膜、使病原菌的原生質(zhì)濃縮等抑制病原菌生長(zhǎng)[11-13]。次級(jí)代謝產(chǎn)物中的小分子量、易揮發(fā)性非極性物質(zhì)，如簡(jiǎn)單的芳香族化合物、丁烯酸內(nèi)酯類(lèi)和吡喃酮類(lèi)聚酮化合物、揮發(fā)性的萜烯類(lèi)、異腈等能在土壤中移動(dòng)，可有效抑制土壤中的病原菌；另一類(lèi)大分子、高分子量的極性物質(zhì)，如木霉素（trichodermin）、peptaibols物質(zhì)等[13-14]對(duì)白絹病、立枯病等有較強(qiáng)的抑制作用，其中木霉素對(duì)水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucmeris）和黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[15-16]。盡管有關(guān)哈茨木霉菌代謝產(chǎn)物的殺菌機(jī)制及利用代謝產(chǎn)物防治水稻等作物病害方面已有研究報(bào)道，但利用哈茨木霉毒素防治桑椹白果病方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。

在前期研究哈茨木霉毒素的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該毒素能有效地抑制白果病病原菌的生長(zhǎng)。因此，本研究主要評(píng)估哈茨木霉粗毒素及其與世高混合物對(duì)核地杖菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，為利用哈茨木霉菌及其代謝產(chǎn)物防治桑葚白果病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和試劑 供試菌株為哈茨木霉菌（T. harzianum）菌株Th-N5（保藏號(hào)為CCTCC No：M2016251），分離于廣州地區(qū)被自然侵染的桑葚白果上。核地杖菌（S. shiraiana）Ss-05菌株分離于廣州地區(qū)被自然侵染的桑葚白果上，保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲(chóng)病原真菌實(shí)驗(yàn)室。核地杖菌的鑒定參考White等[17]的方法，以基因組DNA為模板用ITS1/ITS4為引物（引物序列為5-TCCGTAGGGTGAACCTGCGG-3 / 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）擴(kuò)增其特異的ITS序列，在GenBank中比對(duì)序列以鑒定菌株。哈茨木霉菌和核地杖菌均在PDA培養(yǎng)基上分別于（26±1）、（20±1）℃培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后用0.1%的吐溫-80水溶液洗下孢子，用血球計(jì)數(shù)板將孢子液濃度分別調(diào)整到1×106、1×103個(gè)孢子/mL的備用。

試驗(yàn)所用的世高為市售的苯醚甲環(huán)唑原藥（先正達(dá)投資有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基： 麩皮 ： 玉米粉 = 3.5 ： 1（w/w），蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，硫酸銨2.0%，硫酸鎂1.0%，氯化鈣0.5%。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉毒素的提取 將配制好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基加水拌勻后裝入三角瓶，在121 ℃下滅菌 30 min，冷卻后每瓶接種 l～3 mL孢子液，（25±1）℃恒溫培養(yǎng) 4 d后向固體發(fā)酵產(chǎn)物中分別加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇等4種有機(jī)溶劑，超聲波處理 30 min，浸泡 2 d后過(guò)濾，獲得分別由4種有機(jī)溶劑萃取的提取物（真菌毒素），將提取物減壓濃縮獲得哈茨木霉毒素。

1.2.2 哈茨木霉毒素抑制核地杖菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的生物測(cè)定 向PDA培養(yǎng)基中分別加入1.2.1中經(jīng)4種有機(jī)溶劑提取的哈茨木霉毒素，制備成毒素濃度為10 ?g/mL的PDA固體平板培養(yǎng)基；將濃度為1×103個(gè)孢子/mL的核地杖菌孢子懸浮液30 ?L涂布于含毒素的PDA平板上，以不含粗毒素的PDA平板為對(duì)照，在20 ℃培養(yǎng)并觀察產(chǎn)生的菌落，記錄固體平板上的菌落數(shù)。每個(gè)處理各20個(gè)平板，每個(gè)處理3次重復(fù)。孢子萌發(fā)抑制率=[（對(duì)照區(qū)的菌落數(shù) - 毒素處理區(qū)的菌落數(shù)） /對(duì)照區(qū)的菌落數(shù)] ×100%。將乙醇提取的毒素加入PDA培養(yǎng)基中配制成濃度為1.5、3、6、12、24 ?g/mL的固體平板，取30 ?L濃度為1×103孢子/mL的核地杖菌孢子懸浮液涂布于含不同濃度毒素的PDA平板上，在20 ℃培養(yǎng)、觀察平板上的菌落，以不含毒素的PDA平板為對(duì)照，每日定時(shí)記錄平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)。研究中所用核地杖菌孢子在不含毒素條件下的孢子萌發(fā)率均高于93%。

將核地杖菌的孢子懸浮液涂布于PDA平板上，在20 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)生菌絲，選取菌絲生長(zhǎng)均勻的地方打孔獲得菌絲塊（? 5 mm）。將乙醇提取的毒素加入PDA培養(yǎng)基中配制成濃度為1.5、3、6、12、24 ?g/mL的固體平板，在平板中央接入核地杖菌的菌絲塊，以不含毒素的PDA平板為對(duì)照，在20 ℃培養(yǎng)。采用十字交叉法，每天定時(shí)測(cè)量菌落的直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。菌絲生長(zhǎng)抑制率= [（對(duì)照區(qū)菌落直徑-處理區(qū)的菌落直徑）/對(duì)照區(qū)菌落半徑] ×100%。

1.2.3 世高抑制核地杖菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的生物測(cè)定 將世高加入PDA培養(yǎng)基中配制成濃度為3、6、12、24、48 ?g/mL的固體平板，采用1.2.2的方法測(cè)定世高對(duì)核地杖菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 哈茨木霉毒素與世高的混合物抑制核地杖菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的生物測(cè)定 根據(jù)前面的測(cè)定結(jié)果，將哈茨木霉毒素與世高按不同比例混合，哈茨木霉毒素（乙醇提取物，?g/mL）與世高（?g/mL）的終濃度分別為T(mén)1（3+0） 、T2（6+0） 、T3（3+7） 、T4（3+14）、T5（6+7） 、T6（ 6+14）、T7 （0+7）、T8（0+14）。再將混合物加入PDA培養(yǎng)基中配制成固體平板，采用1.2.2 的方法測(cè)定不同濃度的混合物對(duì)核地杖菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡君歡，蔡岳興，周書(shū)軍，等. 寧波桑果基地菌核病菌的多樣性與ITS初步分析[J]. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版），2011， 24（3）：20-23.

[2] 王國(guó)良. 桑椹菌核病菌多樣性調(diào)查[J]. 菌物研究，2009，7（Z1）：189-192.

[3] Ye M，Yue H，Luo G Q，et al. Effect of a fungal pathogen， Trichoderma hamatum， on growth and germination of Ciboria carunculoides under laboratory conditions. Pakistan Journal of Zoology， 2014，46（5）：1377-1384.

[4] Ye M，Kuang Z，Zhao X，et al. Screening of fungicide to control Ciboria carunculoides under laboratory conditions[J]. Pakistan Journal of Zoology，2014，46（1）：53-59.

[5] Lǚ Z，Kang X，Xiang Z，et al. A laccase gene Sh-lac is involved in the growth and melanin biosynthesis of Scleromitrula shiraiana[J]. Phytopathology， 2016， 107（3）：353-361.

[6] Wang Y，Hou Y P，Chen C J，，et al. Detection of resistance in Sclerotinia sclerotiorum to carbendazim and dimethachlon in Jiangsu Province of China[J]. Australasian Plant Pathology ，2014，43（3）：307-312.

[7] Zhu A Q，Zhou F，Li J L， et al. Carbendazium resistance in field isolates of Scerotinia sclerotiorum in China and its management[J]. Crop Protection，2016，81：115-121.

[8] 郭潤(rùn)芳，劉小光. 拮抗木霉菌在生物防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物防治，2002，18（4）：180-184.

[9] Harman GE. Myths and Dogmas of biocontrol changes in perceptions berived from research on Trichodermin harzianum T-22[J]. Plant Disease，2007，84（4）：377-393.

[10] Harman G E， Howell C R， Viterbo A， et al. Trichoderma species-opportunistic， avirulent plant symbionts[J]. Nature Reviews Microbiology， 2004， 2（1）：43-56.

[11] Schuster A，Schmoll M. Biology and biotechnology of Trichoderma[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87（3）：787-799.

[12] Cardoza R E H M， Vizcaino J A， Sanz L， et al. Secondary metabolites produced by Trichoderma and their importance in the biocontrol process. [M]// Mellado-Dura?n E， Barredo JL （eds） Microorganisms for industrial enzymes and biocontrol. Research Signpost， 2005： 207.

[13] Reino J L， Guerrero R F， Hernández-Galán R， et al. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma[J]. Phytochemistry Reviews， 2008， 7（1）：89-123.

[14] Thrane U，Poulsen S B，Nirenberg H I，et al. Identification of Trichoderma strains by image analysis of HPLC chromatograms[J]. FEMS microbiology letters，2001，203（2）：249-255.

[15] 石一珺，申屠旭萍，俞曉平. 1 株枸骨內(nèi)生真菌菌株的分類(lèi)鑒定及其代謝產(chǎn)物的生防作用研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（4）：362-367.

[16] 潘 順，劉 雷，王為民. 哈茨木霉發(fā)酵液中peptailbols抗菌肽的鑒定及活性研究[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（4）：528-536.

[17] White T J， Bruns T D， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]// Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications. San Diego， CA， USA： Academic Press，1990：315-322.

[18] Xu D，Ali S，Huang Z，et al. Insecticidal activity influence of 20-Hydroxyecdysone on the pathogenicity of Isaria fumosorosea against Plutella xylostella[J]. Biological Control，2011，56（3）：239-244.

[19] Abbott W S. A method for computing the effectiveness of an insecticide[J]. Journal of Economic Entomology， 1925， 18： 265-267.

[20] Peptaibol Database[EwB/OL]. http：//peptaibol.cryst.bbk.ac.uk/home.shtmL.

[21] Degenkolb T， Kirschbaum J， Bruckner H. New sequences， constituents， and producers of peptaibiotics： an updated review[J]. Chemistry & Biodiversity，2007，4（6）：1 052-1 067.

[22] Chugh J K，Wallace B A. Peptaibols：models for ion channels[J]. Biochemical Society Transactions，2001，29（4）：565-570.