尖孢鐮刀菌古巴專化型中SIX2和SIX6基因敲除突變體的生物學特性

楊臘英 陳平亞 郭立佳 梁昌聰 汪軍 劉磊 周游 黃俊生

摘 要 尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，F(xiàn)oc）依據(jù)對寄主易感性分為4個不同的生理小種，其中4號生理小種（Foc4）幾乎能危害目前所有栽培品種。為研究其SIX（secreted in xylem）蛋白編碼基因SIX2和SIX6在Foc4對寄主差異性選擇中的作用，利用PEG介導的原生質(zhì)體轉化法將基于pCT74質(zhì)?？蚣軜嫿ǖ腟IX2、SIX6基因敲除質(zhì)粒分別轉入Foc4 B2菌株，分別得到了SIX2和SIX6基因敲除突變體，然后分析敲除突變體與野生型的生物學特性差異。生物學研究結果表明：SIX2、SIX6基因的缺失突變體均呈現(xiàn)菌絲稀疏、生長速率減慢、產(chǎn)孢率降低、菌絲異核率增加，對滲透壓、外源氧等外源脅迫更為敏感等特征。致病力分析實驗發(fā)現(xiàn)ΔFoSIX2和ΔFoSIX6突變體的孢子在香蕉苗的幼嫩根部附著量減少，孢子根部定殖能力降低；ΔFoSIX2菌株基本上喪失了對巴西蕉的致病力，而對粉蕉仍有較強的致病能力；ΔFoSIX6菌株則對粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈極顯著下降。依據(jù)生物學與致病力測定結果，推測Foc4中SIX6基因決定Foc4對寄主的致病力，而SIX2基因則決定Foc4對寄主的差異性選擇能力。

關鍵詞 香蕉枯萎病菌；基因敲除；生物學特性；SIX（secreted in xylem）蛋白編碼基因；SIX2；SIX6

中圖分類號 Q933 文獻標識碼 A

Abstract There are four recognized races of Fusarium oxysporum f. sp. cubense which are separated based on host susceptibility. Race 4 is capable of attacking ‘Cavendish （AAA） as well as the other varieties of banana affected by races 1 and 2. In order to study the roles of SIX2 and SIX6 genes encoding SIX （Secreted in xylem） protein in host xylem of Foc4 on host diversity selection， SIX2 and SIX6 gene knockout plasmids constructed from pCT74 plasmid framework were transferred into Foc4 B2 strain by PEG-mediated protoplast transformation respectively， SIX2 and SIX6 gene knockout mutants were obtained respectively， then the biological characteristics between knock-out strains and wild-type strains were analyzed. The results of biological studies showed that， compared with wild-type strain， SIX2 and SIX6 gene knock-out mutants had sparse hyphae， slow growth rate， less spores production， increased rate of mycelial heteronuclear， more sensitive to osmotic stress and other exogenous stress. Pathogenicity analysis found that compared with wild-type strain， the spores in both ΔFoSIX2 and ΔFoSIX6 knock-out mutants decreased the adhesion ability to the young roots of banana seedlings and had reduced colonization ability in the roots. ΔFoSIX2 knock-out mutants basically lost the pathogenicity to Musa acuminata AAA Cavendish cv. Bax， while still had a strong pathogenic ability to Musa sp ABB Pisang Awak. The pathogenicity of ΔFoSIX6 knock-out mutants were significantly decreased to M. acuminata AAA Cavendish cv. Bax and Musa sp ABB Pisang Awak. Based on the results of biology and pathogenicity， it was speculated that the SIX6 gene determined the pathogenicity of Foc4 to host， while SIX2 gene determined the ability of Foc4 to select wider hosts.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； gene knock-out； biological characteristics； SIX （Secreted in xylem） protein encoding gene； SIX2； SIX6

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.021

由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense，F(xiàn)oc）引起的香蕉枯萎病是危害香蕉產(chǎn)業(yè)的重大病害之一。 Foc有4個生理小種，其中國內(nèi)香蕉種植區(qū)發(fā)生危害的為1號生理小種（Foc race 1，F(xiàn)oc1）與4號生理小種（Foc race 4，F(xiàn)oc4）。Foc1危害基因型為AAB的Gros Michel及栽培種，F(xiàn)oc4不僅危害對Foc1與2號生理小種敏感的蕉類，還能危害現(xiàn)階段商業(yè)化推廣的Cavendish栽培種，其危害最大[1]。

尖孢鐮刀菌在與寄主的相互作用中分泌幾個特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8～29.9 ku）進入木質(zhì)部中啟動致病力，被稱為SIX（secreted in xylem）蛋白。目前，通過番茄木質(zhì)部蛋白質(zhì)組分析，比較清晰地明確了SIX蛋白在尖孢鐮刀菌番茄?；停‵. oxysporum f. sp. lycopersici，F(xiàn)ol）入侵番茄中的作用，SIX1蛋白激發(fā)存在I-3抗性基因的番茄的效應蛋白觸發(fā)免疫反應，SIX4蛋白為I-2-和I-3抗性基因介導的抗性抑制器，SIX3蛋白是致病因子并激發(fā)存在I-2抗性基因的番茄的效應蛋白觸發(fā)免疫反應[2-5]，需要AVR2-SIX5基因對來激活番茄中的I-2介導的免疫[6]。目前通過反向遺傳學等方法已鑒定了Fol中的SIX1～SIX14共14個SIX-基因[7-13]。前期研究主要是關于Fol 1號生理小種特有的SIX4 蛋白[4，13]，近期研究在Fol 2號和3號生理小種中發(fā)現(xiàn)被轉座子Hormin插入截斷的突變SIX4基因six4T [14-15]，發(fā)現(xiàn)甘藍枯萎病病原菌（F. oxysporum f. sp. conglutinans）存在SIX4基因且為致病因子[16]，致病擬南芥的尖孢鐮刀菌菌株Fo5176存在N-末端信號肽序列缺失的假SIX4b基因[17]。Niu等[18]發(fā)現(xiàn)西瓜病原菌（F. oxysporum f. sp. niveum）中的FonSIX6基因為無毒因子。

目前已在Foc中鑒定存在SIX1、SIX2、SIX6、SIX7、SIX8[19-20]，筆者通過與不同?；途曛械腟IX基因序列比較與分析發(fā)現(xiàn)，用設計的引物序列擴增的Foc中SIX6基因序列可區(qū)分Foc與其他?；蚚21]、SIX2基因序列為Foc4所特有[22]、SIX7基因序列是Foc4中的亞熱帶4號生理小種所有[23]。不同生理小種侵染的香蕉品種存在的差異性與Foc在寄主植物維管束組織中的成功定殖與否可能存在密切關系，而其中的SIX2和SIX6基因可能在其中發(fā)揮著關鍵性作用。目前國內(nèi)外尚無對Foc中相關SIX基因功能研究的報道。本研究擬通過反向遺傳學方法，利用同源重組、PEG介導的原生質(zhì)體轉化等手段，在香蕉枯萎病菌4號生理小種中分別敲除SIX2、SIX6基因，并分別對這2個基因敲除突變體的表型、生理生化性質(zhì)及致病力等特征進行研究，從而探明SIX2、SIX6基因在病原菌中的功能，為香蕉枯萎病的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒 供試Foc4野生型菌株Foc4-B2為本實驗室2005年分離自海南樂東并鑒定保存。質(zhì)粒pCT74（含有真菌啟動子驅動的潮霉素B抗性基因和綠色熒光蛋白GFP基因）由筆者所在單位張欣研究員贈送并由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 察氏培養(yǎng)基配方參見羅志兵等[24]的配方，YEPD培養(yǎng)基參見Yang等[25]的配方，PDB培養(yǎng)液按照方中達[26]的方法配置。

1.1.3 主要試劑和儀器 總RNA提取使用天根公司RNAprep pure Plant Kit試劑盒；反轉錄采用TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Erase試劑盒，DAPI染色液。Eppendorf微量移液器、Eppendorf Mastercycler PCR儀、UVITEC凝膠成像系統(tǒng)、Eppendorf 5417R離心機、Labconco凍干機、PolyScience恒溫水浴鍋、Leica倒置熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus Fluo View FV1000）等。

1.1.4 引物 PCR引物（表1）合成及測序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 SIX2、SIX6基因的敲除及突變體鑒定 以Foc4-B2基因組DNA為模板，分別用設計有酶切位點的FoSIX2-A-F/FoSIX2-A-R與FoSIX2-B-F/FoSIX2-B-R、FoSIX6-A-F/FoSIX6-A-R與FoSIX6-B-F/FoSIX6-B-R引物對PCR擴增得到SIX2、SIX6基因上游與下游序列，將SIX2、SIX6基因上下游序列分別構建到基因敲除載體pCT74的潮霉素B與GFP基因兩端，提取質(zhì)粒后雙酶切獲得基因敲除片段A-Hyg+GFP-B，通過PEG介導的原生質(zhì)體轉化法將敲除片段轉化到病原菌Foc4-B2中，獲得帶有潮霉素抗性的突變體。采用平板稀釋的方法單孢分離轉化子，將純化后的轉化子轉接至含有潮霉素B濃度為100 μg/mL 的PDA固體培養(yǎng)基上，連續(xù)轉接4次后得到穩(wěn)定轉化子并搖菌，按CTAB法提取DNA，分別用4對引物對SIX2、SIX6基因敲除突變體進行鑒定，其中引物對FoSIX2-F1/F2、F3/ FoSIX2-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX2-F/FoSIX2-R鑒定SIX2基因缺失突變體，其中引物對FoSIX6-F1/F2、F3/ FoSIX6-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX6-F/FoSIX6-R鑒定SIX6基因缺失突變體。

1.2.2 敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的表型觀察 參照毛超等[27]的方法對敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6進行表型觀察。

1.2.3 突變體異核體的觀察 用滅菌后的牙簽挑取新鮮野生型WT、ΔFoSIX2和ΔFoSIX6菌絲分別放入含有20 mL PDB 的100 mL三角瓶中，180 r/min，28 ℃搖床中培養(yǎng)2 d。將菌液吸出200 μL滴在載玻片上，向菌液中加入DAPI染色液10 μL，室溫放置10 min后蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察異核體并統(tǒng)計異核率。異核率=異核體細胞數(shù)目/所統(tǒng)計的細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 外源脅迫對敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6生長的影響 將Foc4-B2與突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的10 mm菌餅分別接種在各種添加外源脅迫條件的YEPD培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑并拍照記錄。其中滲透壓脅迫添加0、0.5、1.0 mol/L的NaCl、KCl，外源氧脅迫添加0、25、50 mmol/L的過氧化氫，鋰離子脅迫添加0、0.5、1 mol/L的醋酸鋰，細胞壁選擇性壓力添加0、0.5、1.0 mol/L的甘油和山梨醇，其中H2O2對菌落生長的抑制率采用以下公式計算：抑制率=（D1- D2）/ D1×100%，其中：D1為在不含H2O2的平板上生長的菌落直徑；D2為同一菌株在含不同濃度H2O2平板上生長的菌落直徑。

1.2.5 粗毒素對假莖致病力測定及對巴西蕉苗根的影響 分別將野生型與突變體菌株的5個直徑為10 mm菌餅接種于150 mL PDB 培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃搖床中培養(yǎng)15 d，過濾除菌得到粗毒素，將新鮮的巴西蕉假莖放入試管中，接種2 mL粗毒素。以清水為空白對照，每個處理重復3次，28 ℃密封3 d后觀察并拍照記錄。將野生型與突變體菌株的菌餅分別接種于察氏液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)15 d，獲得的培養(yǎng)液用3層滅菌濾紙過濾后收集濾液，即為所需的粗毒素提取液。選取長勢相同的巴西蕉苗（M. acuminata AAA Cavendish cv. Bax），將苗的根部用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗3遍，在75%酒精中消毒 1 min。將根部分別浸泡在野生型和突變體菌株的粗毒素提取液中。以滅菌后的空白察氏液體培養(yǎng)基為對照CK，3 d后觀察并拍照記錄。

1.2.6 敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6對香蕉苗水培致病性試驗及根部入侵情況觀察 分別將野生型和突變體菌株接到改良察氏培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d。將直徑為10 mm菌餅接種于200 mL PDB培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d。用3層擦鏡紙過濾，收集濾液。4 000 r/min離心后收集沉淀，并用無菌水重懸沉淀，顯微鏡下用血球計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為106 cfu/mL。將長勢大小基本一致的組培袋裝香蕉苗分別侵泡于孢子懸浮液中，對照組侵泡于清水中，以綠色熒光蛋白標記的野生型菌株WT為對照，分別于第3天、第6 天、第9天取香蕉苗根部于共聚焦顯微鏡下觀察侵染情況，拍照記錄。

1.2.7 敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6對巴西蕉、粉蕉致病能力測定 將直徑為10 mm菌餅接種于200 mL PDB培養(yǎng)基中，180 r/min，28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d。用3層擦鏡紙過濾，收集濾液。4 000 r/min離心收集沉淀，并用無菌水重懸沉淀，顯微鏡下用血球計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為106 cfu/mL。采集土壤滅菌后備用，將長至6片葉左右的巴西蕉（M. acuminata AAA Cavendish cv. Bax）和粉蕉（M. sp ABB Pisang Awak）椰康杯苗分別移栽至花盆中并澆水，干旱處理7 d。將100 mL孢子懸浮液均勻澆在根部周圍土壤中，適當澆水，不同突變體菌株每個處理15株，30 d后觀察到巴西蕉的葉片開始出現(xiàn)變黃等癥狀時，隨機取病株進行切根觀察，當野生型的對照病情指數(shù)達到4級左右便全部切根觀察，統(tǒng)計發(fā)病結果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

病情指數(shù)的統(tǒng)計方法如下：1級：球莖不變色；2級：球莖不變色，但根與球莖交接觸處變色；3級：0～5%球莖變色；4級：6%～20%球莖變色；5級：21%～50%球莖變色；6級： 50%以上球莖變色；7級：全部球莖變色；8級：死株。病情指數(shù)=Σ（發(fā)病級數(shù)×該級株數(shù)）/（最高級數(shù)×總株數(shù)）×100。

利用SAS9.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Microsoft Excel XP進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，方差分析采用Duncan新復極差法，數(shù)值采用對數(shù)置換后進行分析。

2 結果與分析

2.1 SIX2、SIX6基因缺失突變體鑒定

為了研究Foc-B2菌株中SIX2、SIX6基因在香蕉枯萎病菌對寄主差異性選擇中的功能，通過構建分別得到了基因敲除載體pCT74-FoSIX2、pCT74-FoSIX6，并通過雙酶切等手段分別獲得了SIX2、SIX6基因敲除片段A-Hyg+GFP-B，將該片段轉化Foc4-B2菌株分別得到了21、19個具有潮霉素抗性的突變體，連續(xù)轉接3代后，隨機取8個突變體提取基因組DNA，使用4對引物FoSIX2-F1/F2、F3/ FoSIX2-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX2-F/FoSIX2-R對SIX2基因缺失突變體進行PCR驗證， FoSIX6-F1/F2、F3/ FoSIX6-F4、Hyg-GFP-F/Hyg-GFP-R和FoSIX6-F/FoSIX6-R對SIX6基因缺失突變體進行PCR驗證，結果表明8個突變體中FoSIX2基因有7個為缺失突變體（圖1），F(xiàn)oSIX6基因有6個為缺失突變體（圖2），同源重組的效率較高。

2.2 敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的表型觀察

通過對敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的菌絲進行顯微觀察后發(fā)現(xiàn)敲除突變體的菌絲與野生型相比略微稀疏（圖3-D～F），而兩者分生孢子的形態(tài)沒有差別（圖3-A～C）。在固體YEPD平板上野生型菌株比敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的生長速度略快，菌絲更為致密；敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的菌絲向外呈輻射狀（圖 4-A～C）。在液體YEPD培養(yǎng)基中，野生型Foc4-B2菌株能形成完整的菌膜，而敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6形成的菌膜疏松，并且有菌絲團形成（圖4-D～F）。

2.3 突變體異核體的觀察

在熒光顯微鏡下可以觀察到突變體的菌絲存在大量的異核現(xiàn)象（圖5-B～C），而野生型的菌絲很少存在異核現(xiàn)象（圖5-A），突變體的孢子存在異核現(xiàn)象而野生型的孢子未能觀察到異核現(xiàn)象（圖5-D～F）。通過對100個菌絲中分隔清晰的細胞進行統(tǒng)計，突變體菌株ΔFoSIX2的菌絲異核率為66%，突變體菌株ΔFoSIX6的菌絲異核率為87.5%，野生型的異核率為17.4%。

2.4 外源脅迫下敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6的生長模型

把不同濃度的氯化鈉和氯化鉀加入到YPD培養(yǎng)基中后加入培養(yǎng)野生型和突變體，結果發(fā)現(xiàn)突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6對于外源環(huán)境的滲透法脅迫更敏感度，在1.0 mol/L NaCl和更高濃度的滲透壓脅迫下無法生長，而野生型在1.5 mol/L NaCl的滲透壓仍能緩慢生長。在同等KCl 滲透壓濃度下，野生型抑制率為50%，而突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6的抑制率分別達62.5%、83.3% （圖6）。

在25、50 mmol/L H2O2的YEPD培養(yǎng)基的平板上，ΔFoSIX2突變體的生長抑制率分別為28.6%和43.4%，ΔFoSIX6突變體的生長抑制率分別為31.5%和55.1%，野生型B2菌株的生長抑制率分別為4.5%和15.8%。在外源氧化脅迫環(huán)境下，ΔFoSIX2和ΔFoSIX6的菌絲生長受到的抑制明顯比野生型菌株受到的抑制更嚴重，當H2O2濃度達到50 mmol/L時候，突變體菌株ΔFoSIX6抑制最嚴重（圖7）。通過觀察在含有不同濃度醋酸鋰的YEPD平板上突變體的生長情況后發(fā)現(xiàn)，各個突變體與野生型相比在鋰離子脅迫情況下的生長沒有明顯的差別（圖7）。

通過觀察不同濃度細胞壁選擇性壓力條件下敲除突變體的生長情況，結果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6菌絲密度略微下降，生長速率較為緩慢，但相互間抑制率差異性不明顯（圖8）。

2.5 粗毒素對巴西蕉假莖及根的影響

野生型粗毒素處理的假莖末端有嚴重的褐變現(xiàn)象，而突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6粗毒素處理的假莖只有略微的褐變現(xiàn)象，CK清水對照處理的香蕉假莖幾乎沒有褐變現(xiàn)象發(fā)生（圖9-A）。對香蕉苗根部處理的試驗結果表明，5 d后野生型粗毒素處理的香蕉苗全部葉片發(fā)黃，萎蔫嚴重，根部褐化腐爛；突變體ΔFoSIX2處理的香蕉苗邊緣的葉片正常，根部部分褐化；突變體ΔFoSIX6粗毒素處理的香蕉苗根部幾乎沒有褐化，葉片略微有一點發(fā)黃。對照組處理的香蕉苗葉片健康程度良好，幼嫩的的香蕉苗根部成白色，與處理之前基本相同（圖9-B）。

2.6 敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6對香蕉苗水培致病性試驗及根部入侵情況觀察

根據(jù)試驗結果（圖10），7 d后野生型菌株處理過的葉片出現(xiàn)明顯的萎蔫現(xiàn)象，香蕉苗根部已經(jīng)褐化并且腐爛。突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6菌株處理過的香蕉苗的葉片幾乎沒有黃化枯萎現(xiàn)象，根部輕微褐化，并且長出白色須根。對照組香蕉苗的根部生長正常，長出白色須根，葉片沒有出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6的回復突變又使其致病能力恢復到野生型。

將野生型和突變體孢子懸浮液處理3 d后的香蕉苗根部放置于共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)GFP標記的野生型菌株和突變體ΔFoSIX2都有部分孢子附著在根部表面。ΔFoSIX6菌株處理香蕉苗根部沒有孢子附著。處理第6天時候，可以觀察到野生型有菌絲侵入香蕉苗的根部，并且野生型菌處理組附著的孢子比突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6菌株附著的孢子多，ΔFoSIX2、ΔFoSIX6處理組香蕉苗根部沒有菌絲侵入。處理第9天，野生型處理的香蕉苗根部組織內(nèi)可以觀察到大量菌絲入侵，突變體處理的香蕉苗根部附著的孢子較少且沒有菌絲侵入。說明ΔFoSIX2、ΔFoSIX6突變體在木質(zhì)部中定殖和分泌蛋白的能力減弱（圖11）。

2.7 敲除突變體ΔFoSIX2、ΔFoSIX6對巴西蕉、粉蕉致病能力測定

相同菌株對粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力測定結果表明（表2）：B2-GFP菌株的病情指數(shù)分別為89.4、50.0，ΔFoSIX2的病情指數(shù)為分別為47.9、16.7，ΔFoSIX6的病情指數(shù)分別為15.0、25.0，而空白對照的病情指數(shù)為12.5、16.7，突變體ΔFoSIX2和ΔFoSIX6處理的粉蕉、巴西蕉發(fā)病情況極顯著性低于野生型 （表2）。同時由表2可看出，突變體ΔFoSIX2菌株基本上喪失了對巴西蕉的致病力，而對粉蕉仍有較強的致病能力；突變體ΔFoSIX6菌株則對粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈極顯著下降。

3 討論

香蕉枯萎?。‵usarium wilt of banana）在世界主要香蕉產(chǎn)區(qū)先后發(fā)生并造成了極為嚴重的危害，是目前困擾世界香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大難題。依據(jù)目前國內(nèi)外防控香蕉枯萎病的研究進展，使用抗病品種是控制香蕉枯萎病最根本的出路[28]，而對相關致病基因的認識可能有助于發(fā)展抗香蕉枯萎的香蕉品種[29]。

SIX蛋白編碼基因在Fol中的功能研究較為清晰，其他尖孢鐮刀菌?；椭械腟IX蛋白質(zhì)可能參與了決定菌株的毒力/無毒性或宿主特異性[16]，如其中的SIX4基因在Fol中為無毒因子，但在甘藍枯萎病病原菌F. oxysporum f. sp. conglutinans中則為致病因子[16]；西瓜病原菌F. oxysporum f. sp. niveum中的FonSIX6基因為無毒因子[18]。Kashiwa等[30]利用等強度均一電場凝膠電泳（contour-clamped Homogeneous Electric Field，CHEF）對Fol 4287菌株及F. oxysporum f. sp. conglutinans菌株的分析，發(fā)現(xiàn)每個小染色體上的SIX基因的特殊組合各不相同；此外，SIX基因位置取決于分離株，并非所有的SIX基因都在小染色體上發(fā)現(xiàn)，有些是在大染色體上。

本研究利用同源重組的手段在Foc4-B2中敲除了SIX2和SIX6基因，通過對敲除突變體與野生型的生物學特性比較后發(fā)現(xiàn)，SIX2、SIX6基因的缺失突變體均有菌絲稀疏、生長速率減慢、產(chǎn)孢率降低、菌絲異核率增加、對溫度、pH及滲透壓等外源脅迫更為敏感等特征。通過致病力實驗發(fā)現(xiàn)，ΔFoSIX2和ΔFoSIX6突變體的孢子在香蕉苗的幼嫩根部附著量減少，孢子入侵數(shù)目降低，ΔFoSIX2菌株基本上喪失了對巴西蕉的致病力，而對粉蕉仍有較強的致病能力；ΔFoSIX6菌株則對粉蕉苗、巴西香蕉苗盆栽致病力均呈極顯著下降。依據(jù)研究結果推測Foc4中SIX6基因為Foc4菌株的致病因子，而SIX2基因則決定Foc4對寄主的差異性選擇能力。

本研究雖然得到了一系列敲除突變體與野生型相比生物學特性上的變化，尤其是對不同香蕉品種致病能力差異的變化，但引起這些變化的分子機制還不清楚。下一步研究的重點將是開展蛋白組學與代謝組學相關研究，進一步明確SIX2與SIX6基因在Foc中的確切作用，為下一步Foc的田間防控尤其是抗病品種的培育提供作用靶標。

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