一種國(guó)外野生沉香的生物活性和化學(xué)成分研究

楊藝玲 李薇 梅文莉 楊錦玲 蔡彩虹

摘? 要? 研究一種國(guó)外野生沉香乙醚提取物的生物活性并分析其化學(xué)成分，為國(guó)外野生沉香的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)。采用乙醚浸提法提取沉香，對(duì)提取物分別用MTT法、Ellman法、pNPG法和貝曼漏斗法進(jìn)行細(xì)胞毒、乙酰膽堿酯酶抑制、α-葡萄糖苷酶抑制和殺全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)活性測(cè)試，利用GC-MS分析提取物化學(xué)成分。結(jié)果表明，該提取物對(duì)5株人體腫瘤細(xì)胞、乙酰膽堿酯酶、α-葡萄糖苷酶和全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)均表現(xiàn)出一定的生物活性。GC-MS檢測(cè)鑒定了其中的26個(gè)化合物，相對(duì)含量為57.39%，包括23個(gè)倍半萜類(lèi)成分，相對(duì)含量為56.72%，1個(gè)2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)成分，相對(duì)含量為0.35%。本次對(duì)此種國(guó)外野生沉香的生物活性和化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)沉香乙醚提取物具有殺線(xiàn)蟲(chóng)的活性，為更好地開(kāi)發(fā)沉香的藥用價(jià)值提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 野生沉香;生物活性;化學(xué)成分;GC-MS中圖分類(lèi)號(hào)? R284.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.021

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）或擬沉香屬 （Gyrinops）植物中含有樹(shù)脂的木材^[1-2]。迄今為止，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ中，共收錄沉香植物23種，其中有8種為擬沉香屬植物，主要分布于中國(guó)的華南及西南、東南亞以及印度尼西亞群島等地區(qū)^[2-3]。沉香在醫(yī)藥、香薰、香水行業(yè)、宗教文化等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是中國(guó)、日本、印度以及其他東南亞國(guó)家的傳統(tǒng)名貴藥材和天然香料^[3-4]。近年來(lái)，沉香因其良好的應(yīng)用價(jià)值和高貴稀有的特性受到廣泛關(guān)注，沉香貿(mào)易目前也保持高速增長(zhǎng)的勢(shì)頭。沉香的研究涉及許多方面，其生物活性也受到了國(guó)內(nèi)外關(guān)注，目前發(fā)現(xiàn)沉香具有神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、解痙、降血糖、治療過(guò)敏及改善慢性腎衰竭等作用^[5-11]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)沉香化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)沉香中的特征性成分為2-（2-苯乙基）色酮和倍半萜兩類(lèi)化合物^[12-13]。2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)化合物包括四氫色酮、雙環(huán)氧色酮、單環(huán)氧色酮、flidersia類(lèi)型色酮和色酮聚合物等。倍半萜類(lèi)化學(xué)物主要有以下九類(lèi)：沉香呋喃（agarofuran）型、沉香螺旋烷（agarospirane）型、愈創(chuàng)木烷（guaiane）型、桉烷（eudesmane）型、艾里莫芬烷（eremophilane）型、杜松烷（cadinane）型、前香草烷（prezizaane）型、菖蒲烷（acorane）型、蛇麻烷（humulene）型等。沉香中色酮和倍半萜化合物種類(lèi)和數(shù)量的不同，一定程度上導(dǎo)致了沉香的質(zhì)量、香味等差異。

目前，沉香中特征性成分的分析方法很多，如紫外分光光度法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC/UPLC-MS）等，其中各類(lèi)聯(lián)用的方法能更準(zhǔn)確分析指認(rèn)沉香的化學(xué)成分。

本文以一種國(guó)外的野生沉香作為研究對(duì)象，對(duì)其乙醚提取物進(jìn)行了細(xì)胞毒、乙酰膽堿酯酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性和全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)致死活性等生物活性測(cè)試，并對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析鑒定，研究結(jié)果為國(guó)外野生沉香的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 沉香樣品? 一種國(guó)外野生沉香樣品于2014年8月購(gòu)買(mǎi)于泰國(guó)曼谷，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，其源植物為沉香屬（Aquilaria）植物的一種，但由于目前全世界分子鑒定基因庫(kù)還未收錄所有沉香屬植物的信息，因此并不能確定其具體的種名。憑證標(biāo)本（201408SLLK）存放于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所（圖1）。

1.1.2 ?細(xì)胞與試劑? 人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人宮頸癌細(xì)胞Hela和人肺腺癌細(xì)胞A549（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)）;陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇（江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司）;RPMI1640完全培養(yǎng)基（Solarbio公司）;DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）;碘化硫代乙酰膽堿、5，5′-二硫-雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）、他克林（Tacrine，純度99%）、α-糖苷酶（酵母來(lái)源）（Sigma公司）;乙酰膽堿酯酶（Solarbio）;阿卡波糖、對(duì)硝基苯-α-葡萄糖苷 （pNPG）、碳酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;線(xiàn)蟲(chóng)Panagrellus redivivus，燕麥片（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）;DMSO（西隴化工股份有限公司）;無(wú)水乙醚（天津市化學(xué)試劑一廠）;GC-MS中使用的試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3? 儀器與設(shè)備? HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱（美國(guó)安捷倫公司）;ELX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）;UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）;HHB11360-S普通培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）;SW-40潔凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）;BP221S萬(wàn)分之一電子秤（北京賽多利斯天平有限公司）;HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋（日本HIRAYAMA公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品制備? 一種國(guó)外野生沉香樣品20.0 g粉碎，以50 mL無(wú)水乙醚超聲提取30 min，靜置5 min后過(guò)濾得到乙醚提取液，重復(fù)3次，合并3次提取液，揮干后得到該沉香的油狀乙醚提取物1.5 g待用。

1.2.2? 細(xì)胞毒活性測(cè)試? 采用MTT法^[14]測(cè)定樣品對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人宮頸癌細(xì)胞Hela和人肺腺癌細(xì)胞A549五株細(xì)胞的抑制活性。樣品活性結(jié)果以IC₅₀（半數(shù)抑制濃度）表示，當(dāng)抑制率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度也就是細(xì)胞毒活性的IC₅₀值。

1.2.3? 乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)試? 采用Ellman法^[15]測(cè)定樣品對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性。樣品活性結(jié)果以其對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率表示。

1.2.4? α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試? 采用pNPG法^[16]測(cè)定樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。樣品活性結(jié)果以樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率表示。

1.2.5? 全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)致死活性測(cè)試? 采用貝曼漏斗法^[17]測(cè)定樣品對(duì)全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)Panagrellus redivivus的致死活性。樣品活性結(jié)果以樣品對(duì)全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)的致死率表示。

1.2.6? GC-MS分析條件? 色譜條件：HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 彈性石英毛細(xì)管柱;初始柱溫50 ℃，保持2 min;以5 ℃/min的速率升溫

至310 ℃，保持10 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He（99.999%）;柱前壓7.62 psi（1 psi = 6.895 kPa），載氣流量1.0 mL/min;分流比40∶1，溶劑延遲時(shí)間3.0 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源、電子能量70 eV、離子源溫度230 ℃、四極桿溫度150 ℃、接口溫度280 ℃、發(fā)射電流34.6 μA、倍增器電壓1 434 V、質(zhì)量掃描范圍20～550 m/z。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 生物活性測(cè)試結(jié)果

從表1可知，國(guó)外野生沉香乙醚提取物對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肺腺癌細(xì)胞A549和人宮頸癌細(xì)胞Hela均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中以人肺腺癌細(xì)胞A549的活性相對(duì)較好，IC₅₀為（28.02±0.94） g/mL。國(guó)外野生沉香乙醚提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶和α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，其中對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性接近陽(yáng)性對(duì)照（表2）。沉香乙醚提取物對(duì)全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)具有較高的致死率，其致死率為45.59%± 0.92%，高于陽(yáng)性對(duì)照的31.64%±3.64%。

2.2? GC-MS分析結(jié)果

該種國(guó)外野生沉香樣品乙醚提取物的總離子流圖見(jiàn)圖2，該沉香乙醚提取物中經(jīng)GC-MS檢測(cè)鑒定了26個(gè)成分（表3），總相對(duì)含量為57.39%;其中倍半萜類(lèi)化合物23個(gè)，相對(duì)含量為56.72%;色酮類(lèi)化合物1個(gè)，相對(duì)含量為0.35%;芳香性化合物1個(gè)，相對(duì)含量為0.17%;豆甾醇1個(gè)，相對(duì)含量為0.15%。

3 ?結(jié)論

本研究采用乙醚冷浸超聲提取法提取一種國(guó)外野生沉香，其乙醚提取物的得率為7.50%，與普通沉香乙醚提取得率（1.3%～9.7%）^[19]相符。據(jù)報(bào)道，沉香中一些倍半萜成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制和安定的作用^{[10， 22-24]}，色酮類(lèi)成分具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用^[25-26]。這些生物活性研究多數(shù)針對(duì)單體化合物，而粗提物的生物活性研究相對(duì)較少且研究單一^[27-28]。基于前人對(duì)沉香生物活性的研究及本課題組的研究條件，本研究對(duì)該沉香乙醚提取物進(jìn)行細(xì)胞毒活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)致死活性測(cè)試。乙酰膽堿酯酶是水解乙酰膽堿的特異性膽堿酯酶，而乙酰膽堿含量降低會(huì)引發(fā)神經(jīng)退行性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)該種沉香乙醚提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶具有一定強(qiáng)度的抑制活性，說(shuō)明其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。本研究中發(fā)現(xiàn)此種沉香乙醚提取物對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肺腺癌細(xì)胞A549和人宮頸癌細(xì)胞Hela的細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抑制活性，說(shuō)明其有一定的抗腫瘤作用。α-葡萄糖苷酶分布于小腸刷狀緣膜上皮細(xì)胞上，是水解碳水化合物的關(guān)鍵酶，他能從低聚糖類(lèi)底物的非還原端切開(kāi)α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，葡萄糖經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液，導(dǎo)致血糖水平的上升，故抑制α-葡萄糖苷酶的活性能夠延緩碳水化合物的消化，減緩葡萄糖的吸收，抑制餐后高血糖。本研究發(fā)現(xiàn)該沉香乙醚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，說(shuō)明其具有降血糖的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)該沉香乙醚提取物對(duì)全齒復(fù)活線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)出較高的致死率，這也說(shuō)明沉香具有殺線(xiàn)蟲(chóng)的活性。

本研究對(duì)基源植物為沉香屬植物的一種國(guó)外野生沉香進(jìn)行GC-MS分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)26個(gè)化學(xué)成分，其中倍半萜類(lèi)成分23個(gè)，2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)成分1個(gè)，芳香性成分1個(gè)，甾體類(lèi)成分1個(gè)，另外還有許多成分無(wú)法鑒定出，從其質(zhì)譜圖分析絕大部分屬于倍半萜類(lèi)成分。本研究鑒定出的倍半萜有菖蒲烷、愈創(chuàng)木烷、桉烷和艾里莫芬烷等沉香常見(jiàn)骨架類(lèi)型，與報(bào)道的倍半萜骨架類(lèi)型基本一致;而許多未能鑒定結(jié)構(gòu)的倍半萜類(lèi)成分表明，本研究所選用的國(guó)外野生沉香中可能含有多種結(jié)構(gòu)新穎的倍半萜成分。除此之外，本研究還鑒定出了沉香的另一種主要特征性成分，即2-（2-苯乙基）色酮類(lèi)成分。

本研究通過(guò)初步的活性研究，為更好的開(kāi)發(fā)國(guó)外野生沉香的藥用價(jià)值提供了一定的研究基礎(chǔ)，同時(shí)采用GC-MS分析該沉香中的化學(xué)成分，為進(jìn)一步追蹤活性物質(zhì)以及揭示國(guó)外野生沉香的化學(xué)成分特點(diǎn)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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