木薯sRNA測(cè)序分析及其開花相關(guān)microRNA的挖掘

叢漢卿 龍婭麗 王榮香 孫化鵬

摘? 要? 為研究木薯花序與葉片中sRNA表達(dá)特性，探索microRNA對(duì)其開花過程的調(diào)控。本研究以木薯品種“華南八號(hào)”花序和幼葉為材料，利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行sRNA測(cè)序分析;并篩選開花相關(guān)microRNAs進(jìn)行表達(dá)特性分析。從花序和幼葉測(cè)序結(jié)果中分別獲得12 092 109條和11 499 655條sRNA序列。花序中篩選出139條已知microRNAs和253條新預(yù)測(cè)microRNA，分別預(yù)測(cè)得到992和3 736條靶基因;幼葉中篩選出134條已知microRNA和191條新預(yù)測(cè)microRNAs，分別預(yù)測(cè)得到979和2 603條靶基因。最終篩選出8種與開花調(diào)控相關(guān)和3種花色調(diào)控相關(guān)的microRNAs。表達(dá)分析顯示，miRNAs在兩樣品間呈現(xiàn)出較大的整體性差異，并且在功能與代謝通路上也不盡相同;開花相關(guān)microRNAs中表達(dá)差異較大的為miR156、miR172和miR169，其中miR156表達(dá)量在花序中高于幼葉，而miR172表達(dá)量在花序中低于幼葉，推測(cè)其功能為抑制后續(xù)的開花過程，避免過度開花。本研究分析了木薯花序與幼葉中sRNA的整體特性，通過表達(dá)差異分析初步明確了microRNAs對(duì)木薯開花的調(diào)控，為進(jìn)一步深入探索奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 木薯;sRNA;microRNA;開花;表達(dá)特性中圖分類號(hào)? S533???? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.015

木薯（Manihot esculentaCrantz）是世界三大薯類作物之一，也是第四大糧食作物，原產(chǎn)地為南美洲，屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（ManihotP. Miller）^[1-2]。木薯的主產(chǎn)區(qū)位于熱帶和亞熱帶地區(qū)^[3]。木薯在中國(guó)廣東、廣西、云南等主產(chǎn)區(qū)不能正常開花結(jié)果以獲得成熟的木薯種子，從而無法在當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)木薯雜交育種工作，其原因在于當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件，因此目前中國(guó)木薯雜交育種工作僅限在海南島開展，而如廣西地區(qū)種植的品種主要依賴從國(guó)外或海南等地引進(jìn)，且品種單一、部分品種已開始退化^[4]。因此，海南以外木薯主產(chǎn)區(qū)無法進(jìn)行雜交育種的問題，已成為中國(guó)木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大課題之一，木薯開花問題的研究就顯得尤為關(guān)鍵。研究和利用木薯開花信號(hào)途徑中關(guān)鍵調(diào)控因子的調(diào)控特性，是利用生物技術(shù)解決這一問題的有力支撐。

MicroRNAs，又稱為miRNAs，長(zhǎng)度為20～24個(gè)堿基的非編碼單鏈小RNA。通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異地結(jié)合在靶基因mRNA上，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或降解基因的表達(dá)，是一種負(fù)調(diào)控因子^[5]。miRNAs廣泛參與植物發(fā)育過程，例如植物器官的形態(tài)建成、激素應(yīng)答、逆境脅迫與營(yíng)養(yǎng)代謝、phasiRNAs和自身代謝的反饋調(diào)節(jié)等功能^[6]。開花作為植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要事件^[7]，受一系列復(fù)雜的內(nèi)源和外源信號(hào)途徑所組成的網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。miRNAs在這一網(wǎng)絡(luò)中，處于相當(dāng)關(guān)鍵的位置，參與了從時(shí)期轉(zhuǎn)變到花芽形成再到花器官分化的整個(gè)過程。

對(duì)木薯sRNA的研究，前人已有很多相關(guān)報(bào)道，涉及miRNAs的挖掘^[8]、ta-siRNAs和順式- siRNAs對(duì)白葉枯病的響應(yīng)^[9]、非生物脅迫下miRNA的表達(dá)^[10]、miRNA對(duì)木薯淀粉合成的影響^[11]以及在木薯不同組織中miRNA的篩選與表達(dá)^[12]，然而至今尚沒有對(duì)于木薯開花相關(guān)miRNAs的針對(duì)性研究報(bào)道。本研究通過對(duì)木薯品種“華南八號(hào)”的花序和幼葉sRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的對(duì)比分析，對(duì)木薯的sRNAs序列進(jìn)行了分類注釋;獲得了大量的miRNA及其靶基因;并挖掘了開花相關(guān)miRNA，根據(jù)其在兩樣品間的表達(dá)特性差異，初步明確了其對(duì)木薯開花的調(diào)控過程。本研究旨在通過木薯開花相關(guān)miRNAs的挖掘和表達(dá)分析，明確有哪些miRNAs參與了開花過程，并初步確定其表達(dá)特性。為進(jìn)一步探索木薯的開花調(diào)控過程，及miRNAs如何在其中發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)，并對(duì)后續(xù)利用分子手段研究和解決除海南外其他中國(guó)木薯主產(chǎn)區(qū)的開花問題提供理論支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料及預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)材料為木薯品種“華南八號(hào)”，2014年9月栽培于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所木薯中心實(shí)驗(yàn)基地。挑選生長(zhǎng)發(fā)育良好、生長(zhǎng)趨勢(shì)均一、花序發(fā)育初期的植株。分別采集完整花序與幼葉，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取? 分別將兩組樣品液氮研磨后，使用Axygen總RNA小量制備試劑盒（Axygen）分別提取幼葉與花序樣品的總RNA，操作步驟參照試劑盒說明書。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并用核酸蛋白分析儀DU800（Beckman Coulter）檢測(cè)濃度和純度。

1.2.2? sRNA測(cè)序? 花序和幼葉樣品的總RNA，送至深圳華大基因（BGI）分別進(jìn)行sRNA測(cè)序，參考基因組為JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias= Org_Mesculenta_er）^[13]。

2.5? 靶基因預(yù)測(cè)

利用psRobot和TargetFinder工作對(duì)已知和新預(yù)測(cè)miRNAs進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，雖然已知miRNAs和新預(yù)測(cè)miRNAs的數(shù)目相差不大，但二者靶基因數(shù)目卻有較大的差距（表3）。新預(yù)測(cè)miRNAs的靶基因數(shù)遠(yuǎn)多于已知miRNAs，因此新預(yù)測(cè)miRNAs有更多的未知功能值得探究。

2.6? 開花相關(guān)miRNAs的篩選與分析

通過參考前期文獻(xiàn)的報(bào)道，篩選出9種與開花相關(guān)的miRNAs（表4）。其中8種為開花調(diào)控相關(guān)，分別為miR156/157、miR159、miR164、miR165/166、miR167、miR169、miR172和miR319a，涉及調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)變、開花時(shí)間及花器官發(fā)育等功能;3類與花色相關(guān)，可調(diào)控花青素合成相關(guān)基因，分別為miR156/157、miR165/166、miR828。其中156家族與165/166家族具有雙重功能，既可以調(diào)控花的生長(zhǎng)發(fā)育，又可調(diào)控花青素的合成，從而進(jìn)一步影響花色。從靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示這些miRNA都具有不同數(shù)目的靶基因位點(diǎn)，miR156/157較多，具有76個(gè)，而miR165/166較少，僅為8個(gè)。

從上述開花相關(guān)的miRNAs中挑選出較為典型的幾個(gè)成員進(jìn)行表達(dá)差異分析（圖5），表達(dá)差異較大（≥2倍）的為miR156、miR172和miR169，其余成員差異并不顯著。

花序中miR156表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于幼葉，約為34倍。高表達(dá)的miR156可抑制SPL家族轉(zhuǎn)錄因子，抑制了植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)期。miR172幼葉中的表達(dá)量約為花序中的3.7倍?；òl(fā)育之前，miR172的靶基因——AP2基因家族成員可以抑制開花，花發(fā)育開始后，其又會(huì)參與調(diào)節(jié)分生組織的形成和器官生成。miR169在花序中表達(dá)量明顯大于幼葉中，約為5.6倍。

表達(dá)差異并不顯著的miRNAs中，miR159在兩樣品中表達(dá)水平基本一致;miR164在花序中略大于幼葉，約1.86倍;miR166在兩者中都具有較高的表達(dá)水平，reads數(shù)皆大于30×10⁴，花序略大于幼葉，約1.35倍，因?yàn)閙iR166除可影響花器官極性外，還可調(diào)控葉片的極性、莖尖和側(cè)面的分生組織的形成、導(dǎo)管的發(fā)育等，所以在2個(gè)樣品中都有較高表達(dá)量;miR167的2個(gè)成員部分基本一致，葉片中含量約為花序中的1.29倍，其靶基因ARF家族作為生長(zhǎng)素響應(yīng)因子，在植物體內(nèi)廣有分布;miR319的reads數(shù)，在花序中50條，幼葉中31條，表達(dá)量較低，差異不夠顯著。miR319家族的序列與miR159很類似，但其靶基因除了TCP外，還可調(diào)控相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子，木薯中較低的表達(dá)量，是否說明其功能與159有冗余，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，可參與花青素合成調(diào)控的miR828，因測(cè)序所獲得的reads數(shù)極少，花序中3條，幼葉中1條。

3? 討論

sRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中，僅有少量低質(zhì)量序列，說明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可為具體分析提供基礎(chǔ)。另有部分測(cè)序reads無法匹配到基因組數(shù)據(jù)上，可能因?yàn)樗褂玫膮⒖蓟蚪M數(shù)據(jù)不夠完整。sRNA的組成非常復(fù)雜，包含有多種非編碼RNA（ncRNA），已知的如miRNA、snRNA、snoRNA和重復(fù)序列（repeat）等都具有其獨(dú)特的生物學(xué)功能。本研究中木薯花序和幼葉中分別有超過70%和80%的sRNAs無法確定其種類和功能，具有進(jìn)一步挖掘和研究的價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，木薯花序樣品中miRNA的整體表達(dá)數(shù)量約為幼葉中的3倍，說明花序中含有更為豐富的miRNA參與開花的調(diào)控，較多的數(shù)量能夠增強(qiáng)其調(diào)控能力，從側(cè)面印證了miRNAs在開花調(diào)控過程中的作用。兩樣品中新預(yù)測(cè)的miRNAs共有257個(gè)成員，其中部分成員前體具有較為完美的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，預(yù)示其有極大可能為真正的miRNA，結(jié)合其預(yù)測(cè)的靶基因信息，具有一定的后續(xù)研究?jī)r(jià)值。在miRNAs的表達(dá)差異方面，根據(jù)DEGseq、GO、KEGG分析結(jié)果可以看出已知兩樣品的miRNAs和新預(yù)測(cè)miRNAs在總體表達(dá)特征、功能、代謝通路上都具有一定的差異，說明了其器官分布和調(diào)控功能的特性。

木薯中具有全部的已有報(bào)道的花發(fā)育相關(guān)miRNAs^[39]，但在可能起調(diào)控花色的miRNAs中，缺少miR858^[40]和miR778^[41]，其中miR858調(diào)控MYB12，miR778的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)會(huì)增加花青素含量，沉默表達(dá)則基本無影響，說明miR778對(duì)花色調(diào)控并非起關(guān)鍵作用。在金魚草和矮牽牛中，miR169能夠抑制C類基因^[42]，推測(cè)木薯花序中的相對(duì)高表達(dá)的miR169可以維持花的正常發(fā)育。差異表達(dá)的miRNAs中較為特別的是對(duì)植物開花進(jìn)行負(fù)調(diào)控的miR156和正調(diào)控的miR172，花序中有更高的miR156和更低的miR172含量。已有研究表明，mi156在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量顯著高于生殖生長(zhǎng)時(shí)期^[43]。猜測(cè)因花序已經(jīng)完成了從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，處于正常的開花進(jìn)程，高表達(dá)的miR156可以抑制植物后續(xù)過度開花?；ㄐ蛑邢鄬?duì)低的miR172表達(dá)量說明AP2類轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用得到了一定的解除，鑒于花的發(fā)育已經(jīng)開始，其主要作用可能為調(diào)控花器官的生成，同時(shí)也抑制植株過度開花，影響植株正常的生理過程。鑒于miR156和miR172相對(duì)較高的表達(dá)數(shù)量及較為懸殊的表達(dá)差異，說明這兩類miRNAs在木薯開花過程中較為活躍，并起著相對(duì)重要的作用。

本研究中的花序樣品為處于不同發(fā)育時(shí)期的雌雄花多種花器官的混合樣品，只能在整體上體現(xiàn)開花相關(guān)miRNAs的表達(dá)特點(diǎn)，無法特異反映其在不同時(shí)期和不同器官中的表達(dá)特性。要明確其具體調(diào)控過程，需要在開花過程中選擇更密集的時(shí)間點(diǎn)，取用更特異的花器官為材料進(jìn)行測(cè)序，并結(jié)合相應(yīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中靶基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本文初步研究了miRNAs在花序和幼葉中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步探索miRNAs如何調(diào)控木薯的開花奠定了基礎(chǔ)，通過后續(xù)研究，可為解決中國(guó)除海南以外主產(chǎn)區(qū)木薯無法正常開花并進(jìn)行雜交育種的問題提供思路。

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