秋水仙素誘導(dǎo)同源四倍體葛薯的研究

陸建農(nóng) 施玉珍 陳海標(biāo) 羅茵茵 殷學(xué)貴

摘 要 不同時(shí)間下用不同濃度的秋水仙素處理葛薯種子，通過(guò)對(duì)突變株形態(tài)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)、解剖學(xué)、光合特性和逆境生理指標(biāo)分析。結(jié)果表明：經(jīng)0.15 g/L秋水仙素和48 h處理時(shí)間誘變效果最佳；與二倍體相比，四倍體葛薯在葉片厚度、氣孔大小、花粉粒大小、花器官大小、塊根等表現(xiàn)出“巨大性”，其莖長(zhǎng)、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉厚、單果重、小花長(zhǎng)、花柱長(zhǎng)、花萼縱橫徑、旗瓣長(zhǎng)、子房縱橫徑等指標(biāo)均顯著大于二倍體；葉綠素含量、凈光合速率、葉片可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸（Pro）含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均極顯著大于二倍體；而丙二醛（MDA）含量低于二倍體。證明四倍體葛薯是一種非常有用的新種質(zhì)，也為葛薯高產(chǎn)和抗性育種指明了新的方向。

關(guān)鍵詞 葛薯；同源四倍體；誘導(dǎo)；光合特性；逆境生理指標(biāo)

中圖分類(lèi)號(hào) S632.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The morphological， agronomic， anatomical， photosynthetic and physiological indexes of the mutant strains of “Pueraria sp.” seeds were analyzed using different concentrations of colchicine at different times. The results showed that the induction rate of tetraploid was the best with 0.15 g/L colchicine and 48 h treatment time. Compared with the diploid， the tetraploid Pueraria showed "greatness" in leaf thickness， stomatal size， pollen size， flower organ size and root tuber. The stem length， stem diameter， leaf length and leaf width， leaf weight， fruit weight， flower length， flower length， calyx vertical and horizontal diameter， vexilla length， ovary vertical and horizontal diameter and other indicators were significantly greater than diploid. The chlorophyll content， net photosynthetic rate， leaf soluble sugar content， soluble protein content， free proline （Pro） content， peroxidase activity （POD）， superoxide dismutase （SOD） activity and catalase （CAT） of the tetraploid Pueraria sp were significantly higher than that of diploid and malondialdehyde（MDA） content decreased. It is proved that tetraploid potato is a very useful new germplasm， and it also points out a new direction for high yield and resistance breeding.

Key words pueraria； autotetraploid； induction； photosynthetic characteristics； stress physiological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.002

葛薯（Pachyrrhyizus erosus Urban）是豆科（Leguminosae）豆薯屬一年生或多年生草質(zhì)藤本植物，又名涼薯、地瓜、土瓜豆和沙葛等[1]。豆薯原產(chǎn)熱帶美洲，主要分布在熱帶和亞熱帶，喜炎熱少雨氣候，國(guó)內(nèi)主要在貴州、四川、湖南、廣東、廣西、陜西南部和臺(tái)灣等地種植[2]。葛薯適用于生食或煮熟食，具有降血壓以及血脂的功效，還可以加工成淀粉和飼料[3]。另外，葛薯成熟的種子、莖、葉含有魚(yú)藤酮，可以制成殺蟲(chóng)劑和提煉成抗腫瘤蛋白[4]。葛薯屬于高產(chǎn)作物，由于塊根皮薄，雨季易裂果造成腐爛，不耐貯藏，使農(nóng)民增產(chǎn)不增收，在我國(guó)葛薯品種單一，不耐低溫、水澇。因此拓寬葛薯種質(zhì)資源、開(kāi)拓新的育種方法是葛薯育種必由之路。

多倍體植物在自然界中廣泛存在，具有細(xì)胞體積大、器官體積大、生物量大、葉片寬厚、生長(zhǎng)速度快、抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)等特性，廣泛應(yīng)用于植物新品種的培育[5-10]。多倍化是植物進(jìn)化的普遍現(xiàn)象，在自然界里多倍體大多分布在環(huán)境惡劣地區(qū)，說(shuō)明植物多倍體比二倍體有更強(qiáng)抗逆能力[11]。在蔬菜生產(chǎn)上，蘿卜（Raphanus sativus L. ）、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）、白菜（Brassica pekinensis Rupr.）、黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni.）、辣椒（Capsicum annuum L.）等植物已成功誘導(dǎo)出多倍體，均表現(xiàn)較強(qiáng)的抗逆性[12-17]。葛薯主要以二倍體（2n=22）存在于自然界，葛薯的研究主要集中在種植、栽培和加工等方面，而關(guān)于加倍的相關(guān)研究至今未見(jiàn)報(bào)道。

鑒于多倍體抗逆性較強(qiáng)的特點(diǎn)和目前葛薯抗性育種的窘境，近幾年本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了葛薯多倍體的誘導(dǎo)和抗性研究，以求在葛薯種質(zhì)創(chuàng)新和高產(chǎn)、抗性育種方面有所突破。本研究在不同時(shí)間下用不同濃度的秋水仙素處理葛薯種子，通過(guò)對(duì)突變株形態(tài)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)、解剖學(xué)、光合特性和逆境生理指標(biāo)分析，以期建立四倍體葛薯誘導(dǎo)體系，并評(píng)價(jià)其抗逆性，為葛薯倍性育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以湛江本地農(nóng)家種葛薯種子為供試材料，由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物分子育種課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 四倍體葛薯的誘導(dǎo) 分別用0%（對(duì)照）、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的秋水仙素溶液處理葛薯種子（溫水處理葛薯種子1 h后放人工氣候箱催芽24 h），避光處理24、48、72 h，每個(gè)處理96粒種子，處理完后用蒸餾水清洗葛薯種子6次，然后移植到96孔育苗盤(pán)中，栽培管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.2 篩選和采樣 植株長(zhǎng)至4～5葉期，根據(jù)誘導(dǎo)植株生長(zhǎng)勢(shì)、葉形、葉厚和花器官等篩選突變體；用解剖學(xué)方法測(cè)量葉片下表皮氣孔大小、密度和花粉粒大小，經(jīng)鑒定為四倍體材料分株編號(hào)，掛牌標(biāo)識(shí)，計(jì)算成活率（成活株數(shù)/處理種子數(shù)）、四倍體誘導(dǎo)率（同源四倍體株數(shù)/處理種子數(shù)）、嵌合體率（嵌合體株數(shù)/處理種子數(shù)）。按掛牌編號(hào)順序，在葛薯主莖倒三葉取樣，每株重復(fù)3次，所取樣品在液氮中迅速冷凍后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二倍體和四倍體葛薯農(nóng)藝性狀測(cè)定 二倍體和四倍體葛薯生長(zhǎng)至開(kāi)花時(shí)，分別測(cè)定葛薯的莖長(zhǎng)、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉厚、單果重、小花長(zhǎng)、花柱長(zhǎng)、花萼縱徑、花萼橫徑、旗瓣長(zhǎng)、子房橫徑、子房縱徑等農(nóng)藝性狀。

1.2.4 光合生理和抗逆生理測(cè)定 光合速率的測(cè)定利用LI-6400光合測(cè)定儀進(jìn)行。每株選完全展開(kāi)的倒三葉進(jìn)行，重復(fù)5次，測(cè)定時(shí)間為晴天9：00～10：00；葉綠素含量測(cè)定采用乙醇-丙酮混合液浸泡法[18]；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[18]；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法[18]； Pro含量測(cè)定采用酸性茚三酮法[18]； MDA含量測(cè)定采用TBA法[18]；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚氧化法[19]；SOD活性測(cè)定采用NBT光化學(xué)還原法[19]；CAT活性測(cè)定高錳酸鉀滴定法[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007整理，用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的秋水仙素和處理時(shí)間誘導(dǎo)四倍體葛薯的效果比較

在不同的時(shí)間下用不同濃度的秋水仙素處理萌動(dòng)葛薯種子，對(duì)其成活率與加倍率有明顯影響。從表1可以看出，在同一濃度秋水仙素處理下，隨著處理時(shí)間增加，成活率降低，四倍體誘導(dǎo)率先升高后降低；在同一處理時(shí)間下，隨著秋水仙素濃度提高，也有成活率降低，四倍體誘導(dǎo)率先升高后降低的趨勢(shì)，嵌合體率總體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。以0.15 g/L秋水仙素和48 h處理時(shí)間誘變效果最好，成活率達(dá)到23.33%，四倍體加倍率18.75%。

2.2 二倍體和四倍體葛薯植株表型的比較分析

2.2.1 二倍體和四倍體葛薯形態(tài)學(xué)特征比較 與二倍體葛薯相比，四倍體葛薯生長(zhǎng)明顯緩慢（圖1-h），葉片大、厚，皺縮扭曲，葉色加深，鋸齒明顯（圖1-a， h）；四倍體葛薯開(kāi)花時(shí)間比二倍體晚7～10 d，花器官明顯比二倍體大（圖1-d～g）；四倍體葛薯塊根明顯比二倍體大（圖1-c）。

2.2.2 二倍體和四倍體葛薯解剖學(xué)特征比較 四倍體葛薯花粉粒明顯比二倍體大，著色淺，且敗育花粉增多（圖2-a），直徑、體積分別增加了56.42%、282.11%（表2）；四倍體葛薯葉片下表皮氣孔明顯比二倍體大（圖2-b），縱、橫徑分別增加了53.08%、46.48%，而氣孔密度減少了63.01%（表2）。

2.2.3 二倍體和四倍體葛薯農(nóng)藝學(xué)性狀比較 從表3可看出，同源四倍體葛薯的莖長(zhǎng)、莖粗、單果重、花萼縱徑、花萼橫徑、旗瓣長(zhǎng)、子房橫徑較二倍體分別增加了82.06%、62.03%、345.85%、38.96%、50.83%、13.21%、114.55%，差異存在極顯著；葉寬、子房縱徑較二倍體分別增加了34.47%、20.57%，差異顯著；葉長(zhǎng)、葉厚、小花長(zhǎng)、花柱長(zhǎng)較二倍增加了4.02%、50.98%、13.66%、12.92%。

2.3 二倍體和四倍體葛薯的葉片光合生理的差異分析

在光合色素含量的比較中，四倍體的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素（a+b）的含量與二倍體相比，分別增加了52.40%、203.64%、84.25%，差異達(dá)到極顯著水平（表4）。在很大程度上植株光合色素含量差異反映了光合作用強(qiáng)度和生物量大小。四倍體光合速率、可溶性糖和可溶性蛋白分別比二倍體增加了136.73%、148.36%和20.35%，與二倍體之間均存在極顯著差異（表5）。

2.4 葛薯二倍體與同源四倍體葉片抗性生理的差異分析

四倍體葛薯的抗性生理指標(biāo)POD、SOD、CAT和Pro含量分別比二倍體提高了79.48%、40.53%、39.67%和25.50%，與二倍體之間存在極顯著差異；而MDA含量降低了42.54%（表6）。

3 討論

前人大量研究表明，植物四倍體抗性比二倍體更強(qiáng)，植物遇到生物和非生物脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)各種途徑啟動(dòng)脅迫信號(hào)，產(chǎn)生抗性[12-17]。加倍后的植株，在形態(tài)和生理上會(huì)有一定的變化，如器官、細(xì)胞變大、抗逆性增強(qiáng)等，某些內(nèi)部代謝物的產(chǎn)量也有所增加。本試驗(yàn)對(duì)葛薯倍性誘導(dǎo)體系、農(nóng)藝性狀、光合特性及逆境生理生化指標(biāo)進(jìn)行了研究，取得的結(jié)果有利于更全面地了解不同倍性植株體之間表型和生理生化指標(biāo)的差異。

本研究表明，在不同時(shí)間用不同濃度（0.5～2.5 g/L）秋水仙素處理萌動(dòng)葛薯種子，當(dāng)秋水仙素濃度過(guò)低，或者處理時(shí)間過(guò)短時(shí)，四倍體的誘導(dǎo)率均很低，還出現(xiàn)嵌合體，當(dāng)秋水仙素的處理濃度過(guò)高或種子的處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，四倍體的誘導(dǎo)率增加，而種子的成活率降低。秋水仙素是一種劇毒誘導(dǎo)劑，對(duì)種子和植株生長(zhǎng)影響較大，隨著秋水仙素濃度提高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂紊亂，甚至出現(xiàn)種子褐化死亡，有些植株在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)死亡。所以需要將秋水仙素與處理時(shí)間合理搭配才能得到理想的成活率與四倍體誘導(dǎo)率，該研究以0.15 g/L秋水仙素和48 h處理時(shí)間誘變葛薯種子效果最好。

通過(guò)染色體加倍，導(dǎo)致有些植物遺傳物質(zhì)增加，表現(xiàn)在植株的器官和植株大小等方面[20]。葛薯是以塊根為收獲的營(yíng)養(yǎng)器官，由于多倍體植株具有營(yíng)養(yǎng)器官的巨大性，能較好滿(mǎn)足葛薯生產(chǎn)的要求。本研究發(fā)現(xiàn)葛薯四倍體植株的形態(tài)特征與二倍體差異較大，莖長(zhǎng)、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉厚、單果重、花長(zhǎng)、花粉粒直徑、體積、氣孔縱、橫徑均比二倍體大。

光合作用是植物很重要的生理現(xiàn)象，對(duì)植物產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，光合作用依賴(lài)光合色素吸收，所以光合色素含量的多少與光合作用的強(qiáng)弱有密切關(guān)系，高光效育種是目前育種家關(guān)注熱點(diǎn)課題[21]。本研究中，四倍體葛薯的凈光合速率較二倍體提高明顯，這為葛薯育種指出了新的方向；四倍體葛薯葉片葉綠素含量較二倍體多，說(shuō)明葉綠素含量的提高是凈光合速率提高的重要原因，積累更多光合產(chǎn)物，為葛薯生長(zhǎng)和產(chǎn)量奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)可以引起這些滲透調(diào)節(jié)物應(yīng)答，提高植物細(xì)胞的保水能力，常作為抗性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。在蘿卜[22]、白菜[23]、蘭花[24]、蘋(píng)果[25]、泡桐[26]等植物中已證明，這些成分和抗性在四倍體中均高于二倍體。本研究中四倍體葛薯的可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量分別比二倍體高，這三種碳水化合物積累為四倍體的高逆境抗性提供了間接證據(jù)。POD、SOD和CAT是一類(lèi)抗逆性酶，對(duì)多種逆境脅迫起到保護(hù)作用。四倍體葛薯POD、SOD、CAT均明顯高于二倍體，這與Xu等[21]和王雅美等[23]研究結(jié)果一致。而MDA是細(xì)胞毒性物質(zhì)，在細(xì)胞積累多少與植物抗性有關(guān)，MDA含量越低，植物的抗性越強(qiáng)。四倍體葛薯MDA比二倍體低，從另一方面印證了四倍體葛薯高于二倍體的抗性，這與Xu 等[21]、王園園等[24]和張曉申等[26]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，同源四倍體葛薯的凈光合速率、葉綠素含量、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)性酶均高于二倍體，而MDA含量卻低于二倍體。作為一種新的種質(zhì)資源和育種方向，四倍體葛薯具有較高的利用價(jià)值和前景，但要揭示葛薯抗逆性機(jī)理并將其真正用于育種，還需做大量的探索研究。

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