甘草葉斑病菌對戊唑醇和異菌脲的敏感性

徐生軍 張海英 王仕元 張新瑞 李建軍

摘要 [目的]明確甘草葉斑病菌對戊唑醇和異菌脲的敏感現(xiàn)狀，評價甘草葉斑病菌對戊唑醇和異菌脲的抗性風(fēng)險。[方法]2016—2017年從甘草病葉上分離獲得22株甘草葉斑病菌，采用菌絲生長速率法分別測定了各菌株對戊唑醇和異菌脲的敏感性。[結(jié)果]22株甘草葉斑病菌對戊唑醇的EC50在0.442 6～2.201 2 μg/mL，平均EC50為（1.180 2±0.426 7） μg/mL，其對戊唑醇的敏感性呈單峰分布，可作為將來進(jìn)行田間甘草葉斑病對戊唑醇抗藥性檢測的敏感性基線，抗性指數(shù)為0.375 0～1.865 1。22株甘草葉斑病菌對異菌脲的EC50在0.096 4～1.639 6 μg/mL，EC50的平均值為（0.352 7±0.329 8） μg/mL，其對異菌脲的敏感性呈單峰分布，可作為將來進(jìn)行田間甘草葉斑病對異菌脲抗藥性檢測的敏感性基線，抗性指數(shù)為0.273 3～4.648 7，菌株WW17-16的抗性指數(shù)為4.648 7，屬于低抗菌株。[結(jié)論]所有供試甘草葉斑病菌株對戊唑醇是敏感的，而對異菌脲已有產(chǎn)生抗藥性的趨勢，生產(chǎn)中需引起高度重視。

關(guān)鍵詞 甘草葉斑病；戊唑醇；異菌脲；敏感性

中圖分類號 S435.672文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0145-04

Abstract [Objective] The aim was to investigate the sensitivity of A.azukiae and assess the resistance risk of A.azukiae to tebuconazole and iprodione.[Method] The sensitivities to tebuconazole and iprodione of the 22 strains of A.azukiae collected from disease foliage from 2016 to 2017 were determined with the method of colonial growthrate.[Result] The EC50 values of these isolates to tebuconazole ranged from 0.442 6 to 2.201 2 μg/mL，with the mean value of （1.180 2±0.426 7） μg/mL，the sensitivity of these isolates appeared as a single peak curve，which could be used as the relative baseline sensitivity of A.azukiae to tebuconazole.The resistance index ranged from 0.375 0 to 1.865 1.The EC50 values of these isolates to iprodione ranged from 0.096 4 to 1.639 6 μg/mL，with the mean value of （0.352 7±0.329 8） μg/mL，the sensitivity of these isolates appeared as a single peak curve，which could be used as the relative baseline sensitivity of A.azukiae to iprodione.The resistance index ranged from 0.273 3 to 4.648 7.The resistance index of strain WW1716 was 4.648 7，which belonged to low resistance isolate.[Conclusion] All the tested A.azukiae isolates are sensitive to tebuconazole，while have been generated trend of resistance to iprodione and more attention needed to be paid in production.

Key words Leaf spot of Glycyrrhiza；Tebuconazole；Iprodione；Sensibility

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）屬豆科多年生草本植物，是一種廣泛用于醫(yī)藥和食品等行業(yè)的大宗植物原料[1-3]，廣泛分布于我國西北干旱區(qū)域的甘肅和寧夏等省、區(qū)的部分地區(qū)，其中甘肅省主要分布于河西走廊地區(qū)[3]。由豆鏈格孢（Alternaria azukiae）引起的甘草葉斑病是目前甘草種植中的主要病害之一。近年來，甘肅省的甘草種植面積穩(wěn)步增加，多年連茬種植致使葉斑病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，影響了光合作用，由于防治措施不合理，導(dǎo)致甘草產(chǎn)量和品質(zhì)明顯降低，發(fā)病嚴(yán)重時病葉率高達(dá)80%以上，成為影響甘草生產(chǎn)的主要障礙[4-5]。

由于甘草葉斑病在甘肅省嚴(yán)重發(fā)生的歷史不長[4]，尚未有針對該病害防治的技術(shù)儲備，也無藥劑登記用于該病害的防治。目前，對甘草葉斑病除采取以加強(qiáng)栽培管理為基礎(chǔ)的農(nóng)業(yè)防治外，控制該病的主要手段仍然是使用在其他作物上登記的用于防治鏈格孢引起病害的化學(xué)農(nóng)藥。異菌脲是一種廣譜觸殺型保護(hù)性的二甲酰亞胺類殺菌劑，也具有一定的治療作用，適用于防治農(nóng)作物的灰霉病和早疫病等多種病害。異菌脲的作用位點單一，推廣大量使用后不久，田間就出現(xiàn)了抗藥菌株，導(dǎo)致異菌脲防效的下降，甚至失效[6]。戊唑醇是一種三唑類殺菌劑，通過阻礙真菌麥角甾醇的生物合成引起真菌細(xì)胞膜的破環(huán)和細(xì)胞死亡，對多種農(nóng)作物病害具有良好的防治效果[7]。異菌脲和戊唑醇盡管已經(jīng)在多種農(nóng)作物上登記使用，但鮮見在甘草上登記用于防治葉斑病。鑒于此，筆者開展了甘肅省甘草葉斑病種群對常用殺菌劑的敏感性離體評價，以期為進(jìn)一步研究殺菌劑的田間防效和有效防治技術(shù)以及殺菌劑抗性監(jiān)測和治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

96%異菌脲（Iprodione）和97%戊唑醇（Tebuconazole）均由山東濰坊潤豐化工股份有限公司提供。2種殺菌劑原藥分別溶于二甲基亞砜（DMSO），配成濃度為50、250、500、2 500、5 000 μg/mL的戊唑醇母液和濃度為0.5、5.0、50.0、500.0、5 000.0 μg/mL的異菌脲母液，4 ℃保存，備用。

1.2 病原菌的分離

2016—2017年在甘肅省武威市和榆中縣采集典型葉斑病病樣，經(jīng)常規(guī)組織分離法分離甘草葉斑病菌。根據(jù)柯赫氏法則把所分離的葉斑病菌回接到甘草葉片，接種15 d后產(chǎn)生相同病害癥狀且在病斑上發(fā)現(xiàn)相同病菌時，把該病菌判斷為葉斑病病原菌。

1.3 甘草葉斑病菌對2種殺菌劑的敏感性鑒定

采用生長速率法。將預(yù)培養(yǎng)7 d的甘草葉斑病菌用6.5 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，把菌餅分別接種到含有0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μg/mL異菌脲和0、0.1、0.5、1.00、5.00、10.00 μg/mL戊唑醇的PDA培養(yǎng)基上，每個處理重復(fù)3次。將接種后的平板放入25 ℃培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)7 d，對照（加1 mL DMSO）菌落直徑至少40 mm時，采用十字交叉法測定菌落直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 用Excel 2010軟件計算各處理的抑菌率，將抑菌率轉(zhuǎn)化為幾率值，藥劑濃度轉(zhuǎn)化為對數(shù)值，求出毒力線性回歸方程，根據(jù)方程計算有效抑制中濃度（EC50）。以EC50對數(shù)值為橫坐標(biāo)，菌株分布頻率為縱坐標(biāo)，繪制頻率分布柱狀圖。用SPSS 17.0軟件對EC50做正態(tài)分布檢驗。根據(jù)病原菌對異菌脲和戊唑醇的敏感性頻率分布曲線建立病原菌對異菌脲和戊唑醇的敏感性基線，確定抗性指數(shù)和抗性菌株頻率?？剐灾笖?shù)≤3為敏感菌株；3<抗性指數(shù)≤10為低抗菌株；10<抗性指數(shù)≤100為中抗菌株；抗性指數(shù)>100為高抗菌株[8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

2016年在武威市共分離出5株葉斑病菌。2017年在甘肅省的2個地區(qū)共分離出17株甘草葉斑病菌。其中，在武威市共分離出14株葉斑病菌，在榆中縣共分離出3株葉斑病菌（表1）。

2.2 甘草葉斑病菌對2種殺菌劑的敏感性反應(yīng)

2.2.1 甘草葉斑病菌對異菌脲和戊唑醇的敏感性分析。

采用菌絲生長速率測定法，測定分離來自甘肅省各地區(qū)的甘草葉斑病菌對2種殺菌劑的敏感性（表1）。異菌脲的敏感性測定結(jié)果顯示，所測定的22株菌的EC50分布在0.096 4～1.639 6 μg/mL，EC50的平均值為（0.352 7±0.329 8）μg/mL，最不敏感菌株WW17-16的EC50是最敏感菌株WW16-5的17.01倍，最敏感菌株和最不敏感菌株都來自武威市，說明供試甘草葉斑病菌對異菌脲的敏感性存在一定差異。不同年份和不同地區(qū)分離的甘草葉斑病菌對異菌脲的敏感性之間不存在差異（表2）。

戊唑醇的敏感性測定結(jié)果顯示，測定的22株菌的EC50分布在0.442 6～2.201 2 μg/mL，EC50的平均值為（1.180 2±0.426 7）μg/mL，最不敏感菌株WW17-11的EC50是最敏感菌株YZ17-3的4.97倍，最敏感菌株YZ17-3來自榆中縣，最不敏感菌株WW17-11來自武威市，說明供試甘草葉斑病菌對戊唑醇的敏感性存在一定差異。不同年份和不同地區(qū)分離的甘草葉斑病菌對戊唑醇的敏感性之間無顯著差異（表2）。

2.2.2 甘草葉斑病菌對2種殺菌劑敏感基線的建立。

甘草葉斑病菌對異菌脲的EC50分布在0.096 4～1.639 6 μg/mL，經(jīng)SPSS軟件的正態(tài)檢測得P=0.795>0.05，表明這22個菌株對異菌脲的敏感性頻次分布符合正態(tài)分布，呈連續(xù)的單峰曲線（圖1A），試驗所得22株菌的平均EC50（0.352 7 μg/mL）可作為甘草葉斑病菌對異菌脲的敏感基線。

甘草葉斑病菌對戊唑醇的EC50在0.442 6～2.201 2 μg/mL，經(jīng)SPSS軟件的正態(tài)檢測得P=0.801>0.05，表明這22株菌對戊唑醇的敏感性頻次分布符合正態(tài)分布，呈連續(xù)的單峰曲線（圖1B），試驗所得22株菌的平均EC50（1.180 2 μg/mL）可作為甘草葉斑病菌對戊唑醇的敏感基線。

2.2.3 甘草葉斑病菌對2種殺菌劑的敏感程度分析。

根據(jù)測定的甘草葉斑病菌對異菌脲的敏感性基線值（0.352 7 μg/mL），抗性指數(shù)為0.273 3～4.648 7。所有供試菌中，抗性指數(shù)低于3的菌有21株，屬于敏感菌株，頻率為95.45%；抗性指數(shù)在3～10的菌有1株，該菌來自武威市分離的WW17-16，抗性指數(shù)為4.648 7，屬于低抗菌，頻率為4.55%。說明武威市的甘草葉斑病菌已有對異菌脲產(chǎn)生抗藥性的趨勢。

根據(jù)測定的甘草葉斑病菌對戊唑醇的敏感性基線值（1.180 2 μg/mL），抗性指數(shù)為0.375 0～1.865 1。所有供試菌的抗性指數(shù)均小于3，屬于敏感菌，表明2016年和2017年甘肅省各地區(qū)分離的所有菌對戊唑醇是敏感的（表3）。

3 結(jié)論與討論

甘草作為甘肅省主要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積逐年穩(wěn)步增加，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的脫貧致富起到了積極作用。然而近年來，甘草葉斑病發(fā)生逐年遞增，成為影響甘草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。由于對該病害的重視程度不足，研究投入缺乏，導(dǎo)致在病害發(fā)生后缺乏有效的防控措施，致使損失慘重，已成為甘肅省甘草生產(chǎn)中病害防控的主要問題之一。目前，甘草葉斑病的防治主要還是依賴使用鏈格孢引起病害防治的化學(xué)藥劑。尚未有甘草葉斑病上登記使用的化學(xué)藥劑，而室內(nèi)敏感性測定結(jié)果可以為田間防治提供一定參考。

該研究通過評價采自甘肅省武威市和榆中縣的22株甘草葉斑病菌對異菌脲和戊唑醇的敏感性，以2種藥劑EC50的平均值作為其敏感基線，為有選擇性地開展田間藥效試驗以及定期監(jiān)測甘肅省甘草葉斑病菌種群抗藥性提供了依據(jù)。該研究表明，異菌脲對甘草葉斑病菌的平均EC50是0.352 7 μg/mL，21株菌的抗性指數(shù)低于3，1株菌的抗性指數(shù)在3～10，屬于低抗菌，說明武威市的甘草葉斑病菌已有對異菌脲產(chǎn)生抗藥性的趨勢。這結(jié)果與異菌脲對草坪草幣斑病菌[10]、草莓灰霉病[11-12]均產(chǎn)生抗藥性的結(jié)果一致。異菌脲與同屬于二甲酰亞胺類殺菌劑存在交互抗性[11]，因此，應(yīng)該限制這類殺菌劑的使用或減少使用次數(shù)，建議優(yōu)先選用其他作用機(jī)制或類型的新型殺菌劑與之輪換使用。戊唑醇對甘草葉斑病菌的平均EC50是1.180 2 μg/mL，抗性指數(shù)均小于3，說明戊唑醇對甘草葉斑病菌有很好的抑制效果，而且未出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性群體。這結(jié)果與戊唑醇對馬鈴薯早疫病菌[7]、蘋果斑點落葉病菌和蘋果輪紋病[13-15]均未產(chǎn)生抗藥性的結(jié)果一致。真菌對戊唑醇產(chǎn)生抗性受多基因控制，在自然界中難以形成抗性群體，因此認(rèn)為病原菌對戊唑醇在田間產(chǎn)生抗性的風(fēng)險很低。但是近幾十年來因為戊唑醇的大量推廣使用，目前開心果枝枯病菌（Botryosphaeria dothidea）[16]和草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum）[17]對戊唑醇產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。因此，定時監(jiān)測甘草葉斑病菌對戊唑醇的抗藥性對于今后田間抗藥性監(jiān)測和治理至關(guān)重要。為防止甘草葉斑病菌抗藥性的產(chǎn)生，在實際應(yīng)用中需根據(jù)甘草葉斑病的發(fā)生規(guī)律等情況，輪換使用異菌脲和戊唑醇等殺菌劑，以有效控制甘草葉斑病的發(fā)生危害。

該研究用于建立敏感基線的菌株數(shù)量是22株，不符合統(tǒng)計學(xué)對樣本容量的要求（≥30），降低了該敏感基線的可靠性。分析不同年份和不同地區(qū)分離的甘草葉斑病菌對異菌脲和戊唑醇的敏感性之間的差異性，菌株數(shù)量過少，未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性，不能準(zhǔn)確地分析結(jié)果。鑒于甘草葉斑病菌對殺菌劑有產(chǎn)生抗藥性的趨勢，對殺菌劑的敏感性進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測非常必要。也鑒于該研究中菌株數(shù)量不符合統(tǒng)計學(xué)的要求，在今后的研究中要滿足統(tǒng)計學(xué)上樣本容量的要求，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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