三羥基異黃酮對(duì)脂肪酸氧化關(guān)鍵酶的調(diào)控研究

代子玲 范遠(yuǎn)景 楊登玲 徐柳 童金柱 婁鵬翔

摘要 [目的]探討三羥基異黃酮（Genistein， Gen）對(duì)非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）模型中脂肪酸β氧化限速酶肉堿棕桐酰轉(zhuǎn)移酶1（Carnitine acetyltransferase 1，CPT-1）的調(diào)節(jié)作用。[方法]油酸誘導(dǎo)細(xì)胞建模，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定三羥基異黃酮處理后細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）和CPT-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。[結(jié)果]Gen能經(jīng)由PPARs途徑上調(diào)CPT-1 mRNA的表達(dá)。 [結(jié)論]該研究為三羥基異黃酮在臨床藥理上的應(yīng)用以及非酒精性脂肪肝的預(yù)防治療和藥物研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 三羥基異黃酮；非酒精性脂肪肝病；過氧化物酶體增殖物激活受體α； 肉堿棕桐酰轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號(hào) S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）16-0097-03

Abstract [Objective]To investigate the regulatory mechanism of Genistein on CPT1， a key ratelimiting enzyme of fatty acids in NAFLD model. [Method]The expression of mRNA PPARα and CPT1 were measured by realtime fluorescence quantitative PCR. [Result] Gen can regulate the mRNA expression of CPT1 through via PPARs pathway. [Conclusion]The study provides a test basis for the application of Genistein in clinical pharmacology and the prevention and treatment of NAFLD.

Key words Genistein；NAFLD；PPARα；CPT1

三羥基異黃酮（Genistein， Gen）是大豆異黃酮的主要活性成分，特有的類似雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其具有多種分子學(xué)效應(yīng)，表現(xiàn)在影響癌變、肥胖、骨質(zhì)疏松和代謝綜合征等方面，在預(yù)防和治療常見疾病方面起著重要作用[1]。相關(guān)研究表明Gen能廣泛參與調(diào)控人體脂質(zhì)代謝、脂肪酸代謝等多種生理學(xué)活動(dòng)，對(duì)脂質(zhì)代謝有關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)控，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞合成與分化，改善脂質(zhì)代謝[2]。非酒精性脂肪肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一種由多種因素共同作用產(chǎn)生的慢性肝類疾病，雖無過量飲酒，但伴隨肝細(xì)胞變性和脂肪沉積等癥狀[3]，其發(fā)病率正在逐年提高，已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外的重視[4-5]。研究表明NAFLD在人群中的流行率為20%～30%，且在成人和高工業(yè)化的國(guó)家中發(fā)病率更高[6]。過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome proliferatorsactivated receptors α，PPARα）、肉堿棕桐酰轉(zhuǎn)移酶（Carnitine acetyltransferase 1， CPT-1）分別是脂肪酸氧化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵限速酶，CPT-1是PPARα的重要下游靶基因[7]。脂肪酸氧化異常是NAFLD的重要發(fā)病因素之一，NAFLD作為一種常見的肝病，通常伴隨著游離脂肪酸水平過高、甘油三酯沉積等一系列癥狀[8]。目前，NAFLD對(duì)人們的健康有著嚴(yán)重威脅，但國(guó)際機(jī)構(gòu)迄今尚未批準(zhǔn)任何藥物作為治療非酒精性脂肪肝的公開藥品，研制與開發(fā)治療非酒精性脂肪肝藥物和治療手段迫在眉睫[9]。筆者研究了Gen對(duì)脂肪酸氧化的調(diào)控作用，對(duì)預(yù)防和開發(fā)NAFLD藥物具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)細(xì)胞。試驗(yàn)用到的細(xì)胞包括人肝癌細(xì)胞HepG2、人肝癌細(xì)胞Hep3b、人正常肝細(xì)胞L-O2、小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院體外典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要儀器。HH.CP-01W型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司）；BDS 200型倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化技術(shù)公司）；CT14RD高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）； iQTM5多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Bio-Rad 公司）。

1.1.3 主要試劑。三羥基異黃酮（Gen）、非諾貝特（F），購(gòu)自上海生工；油酸（OA），購(gòu)自SigmaAldrich；DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自上海普飛生物公司； IBMX、地塞米松、胰島素，購(gòu)自Cay Chemical；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)。從NCBI上獲取人和小鼠CPT-1、HMGCS1、ACC基因序列，使用IDT（Integrated DNA Technologies）進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，利用NCBI/BLAST對(duì)引物進(jìn)行特異性校對(duì)。人CPT-1 F： CAGCAAGTGGAGCTGTTTGA，R： TGAGGTTCTCTCCCACAAGG； 小鼠CPT-1 F：GATGTGGACCTGCATTCCTT，R：TCCTTGTAATGTGCGAGCTG；人β-actin F：AGCCATGTACGTAGCCATCCA，R：TCTCCGGAGTCCATCACAATG；小鼠β-actin F：ACGAGGCCCAGAGCAAGAG，R：GGTGTGGTGCCAGATCTTCTC。試驗(yàn)所用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物是由上海生工提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理。

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)。按照90 mL（DMEM），胎牛血清（FBS）10 mL，青鏈霉素混合溶液1 mL（購(gòu)自上海生工）比例配制完全培養(yǎng)基。細(xì)胞復(fù)蘇后，次日換液，當(dāng)培養(yǎng)瓶底面有70%～85%細(xì)胞覆蓋時(shí)即進(jìn)行1∶2傳代。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，2 d傳代1次，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1需誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞才能進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。3T3-L1的成熟誘導(dǎo)分化主要步驟：①取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期3T3-L1接種于細(xì)胞板，放于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；②加入分化液I（含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰島素的高糖培養(yǎng)基）于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；③48 h后，換用誘導(dǎo)分化液Ⅱ（含5 mg/L胰島素的高糖培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng) ；④每隔48 h換誘導(dǎo)分化液 Ⅱ 1次，12 d左右基本誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1.2 細(xì)胞分組。將對(duì)數(shù)期細(xì)胞種于12孔板，培養(yǎng)過夜。1 mmo/L油酸誘導(dǎo)24 h后進(jìn)行加藥處理，試驗(yàn)分為空白組（Control）；模型組（1 mmol/L OA）； Gen組（0、15、30、60、120 μmol/L）、陽性對(duì)照PPARα激動(dòng)劑非諾貝特（F）組（10、20 μmol/L）。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞加藥后置于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)總RNA的提取，細(xì)胞RNA提取采用Trizol法。按照 cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書要求將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用紫外核酸檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為20 μL：Fast SYB R Mixture 10 μL；上下游引物各0.4 μL；模板cDNA 2 μL；RNase-Free ddH2O 7.2 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性25 s；95 ℃變性3 s；60 ℃退火30 s；55 ℃延伸30 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞RNA的定量分析 高質(zhì)量的RNA對(duì)于獲取cDNA極其重要。RNA溶液在260、280 nm下的吸光度值代表核酸和蛋白吸收值，可由此確定RNA的質(zhì)量。OD260/OD280大于2.0時(shí)，說明RNA被降解成單核酸；OD260/OD280

小于1.8時(shí)，說明溶液中可能有蛋白等其他污染；OD260/OD280在1.8～2.0，說明提取出來的RNA純度和完整度滿足要求，可用于后續(xù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

2.2 Gen對(duì)細(xì)胞PPARα、CPT-1的mRNA表達(dá)的影響 由圖1、2可知，整體上，油酸誘導(dǎo)組PPARα、CPT-1的mRNA表達(dá)略高于空白組。Gen試驗(yàn)組內(nèi)，不同劑量處理組與模型組相比， PPARα 、CPT-1的mRNA表達(dá)與Gen濃度呈正相關(guān)，即隨著Gen劑量的不斷增加，PPARα、CPT-1的mRNA表達(dá)也隨之增加，具有顯著的劑量效應(yīng)，說明Gen能調(diào)節(jié)PPARα、CPT-1的mRNA表達(dá)。陽性藥物PPARα激動(dòng)劑F組內(nèi)，F(xiàn)對(duì)PPARα、CPT-1的mRNA表達(dá)有顯著的調(diào)控作用。4種細(xì)胞中Gen、PPARα激動(dòng)劑F對(duì)人正常肝細(xì)胞L-O2、小鼠3T3-L1的上調(diào)力度大于2種人肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3b，說明正常細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間可能存在著代謝機(jī)制上的差異。高劑量Gen的作用效果與PPARα激動(dòng)劑一致，說明Gen對(duì)CPT-1的調(diào)節(jié)是經(jīng)由PPARs通路實(shí)現(xiàn)的，通過上調(diào)PPARα的表達(dá)，增加下游靶基因CPT-1的表達(dá)，進(jìn)而加強(qiáng)脂肪酸β-氧化，緩解因體內(nèi)游離脂肪酸過多而導(dǎo)致大量甘油三酯的生成和積蓄。該結(jié)論揭示了Gen在緩解和改善NAFLD發(fā)生發(fā)展中脂肪酸氧化障礙上的重要作用，為尋找治療NAFLD的藥物研究提供了新的思路。

3 結(jié)論與討論

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于多酚類混合物，多分布于大豆子葉和胚軸中，主要的食物來源是大豆及豆制品，三羥基異黃酮在大豆中主要以糖苷的形式存在，三羥異黃酮可作為維持機(jī)體代謝動(dòng)態(tài)平衡，預(yù)防和治療與代謝綜合征、癌癥等相關(guān)的一些常見疾病的關(guān)鍵化學(xué)成分[10]。

脂肪在肝臟中的積累是由脂肪代謝異常引起的，其中脂肪酸氧化障礙導(dǎo)致的脂肪大量積聚，是NAFLD形成的主要原因之一。相關(guān)研究表明因過度積累的甘油三酯和高水平的游離脂肪酸等誘發(fā)的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，脂肪酸氧化受阻，伴隨著氧化應(yīng)激、活性氧生成及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相應(yīng)機(jī)制被激活進(jìn)一步加劇NAFLD形成[11]。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）屬于Ⅱ型核激素受體超家族中的一員，是脂質(zhì)激活的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控機(jī)制一般是配體激活后與視黃醇類×受體（retinoid×receptor，R×R）形成異二聚體，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（peroxisome proliferator response element，PPRE）結(jié)合，從而調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄[12]。PPARs被配體激活后能發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)控體內(nèi)的脂肪細(xì)胞分化、葡萄糖代謝、脂肪酸代謝、炎癥反應(yīng)等多種代謝活動(dòng)，在維持機(jī)體正常生理生化過程中發(fā)揮了重要作用[13]。PPARα是PPARs核轉(zhuǎn)錄家族的一員，在脂肪合成、脂質(zhì)代謝和胰島素敏感等生理代謝過程中，尤其是參與脂肪酸β氧化作用的一些重要酶類表達(dá)中，PPARs發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[14]。當(dāng)前，很多研究者已經(jīng)把開發(fā)PPAR配體作為治療NAFLD的重要靶點(diǎn)[15]。相關(guān)試驗(yàn)表明非諾貝特能通過改善肝脂肪變性，上調(diào)脂肪酸β氧化基因表達(dá)調(diào)控脂質(zhì)積蓄，緩解脂肪肝，雖有一定效果，但在藥物毒性等方面還不盡如人意[16]。

該試驗(yàn)以此為切入點(diǎn)深入研究Gen經(jīng)由PPARs信號(hào)通路對(duì)脂肪酸代謝調(diào)控的具體作用機(jī)制，結(jié)果表明Gen對(duì)脂肪酸氧化關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子PPARα、關(guān)鍵限速酶CPT-1的調(diào)節(jié)作用與PPARα激動(dòng)劑一致，能上調(diào)PPARα、CPT-1 mRNA的表達(dá)，且隨著Gen濃度的增加，上調(diào)幅度增加，呈顯著的劑量依賴效應(yīng)。該試驗(yàn)表明Gen通過PPARs信號(hào)通路，在促進(jìn)脂肪酸氧化，使細(xì)胞脂肪酸含量減少，進(jìn)而改善脂肪大量積聚現(xiàn)象，緩解和改善脂肪肝進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。

目前對(duì)非酒精性脂肪肝的治療，還停留在預(yù)防、單一代謝功能紊亂的針對(duì)性治療、保守的延緩治療以及肝移植上，研制和開發(fā)特異性的具有多重藥理功效的藥物及其治療方式需要更多體內(nèi)外試驗(yàn)的成果、需要掌握更加全面的系統(tǒng)化代謝機(jī)制，并將理論、科學(xué)試驗(yàn)和臨床測(cè)試科學(xué)地結(jié)合起來，這些都有待于更深一步的摸索與研究。

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