湖羊GDF9基因多態(tài)性和產(chǎn)羔性能的關(guān)系

顧祝榮，郭海燕，王強(qiáng)，李擁軍，瞿靜雯，楊媛

摘要 [目的]研究湖羊GDF9基因多態(tài)性和產(chǎn)羔性能的關(guān)系。[方法]以湖羊?yàn)樵囼?yàn)對象，對湖羊GDF9基因做PCR-SSCP多態(tài)性檢測，分析多態(tài)性對湖羊產(chǎn)羔性能的影響。[結(jié)果]檢測出3種基因型，定義為GG、AG、AA?；蛐蜏y序顯示，在152 bp處發(fā)生了A被G堿基替換而發(fā)生突變。GG基因型頻率、AG基因型頻率和AA基因型頻率分別為0.107、0.883和0.010。湖羊GG、AG和AA基因型的第1，2胎平均產(chǎn)羔數(shù)分別為2.068、2.025和1.500。3種基因型對第1胎產(chǎn)羔數(shù)沒有影響；第2胎產(chǎn)羔數(shù)GG、AG與AA之間有顯著性差異，表明GDF9基因?qū)虻?胎產(chǎn)羔數(shù)有影響。從第1、2胎的平均產(chǎn)羔數(shù)來看，差異不顯著，但GG和AG基因型的產(chǎn)羔數(shù)相對AA基因型較高。[結(jié)論]GDF9基因?qū)d羊正常的繁殖是必需的，且該基因?qū)虍a(chǎn)羔數(shù)有一定影響。

關(guān)鍵詞 湖羊；GDF9基因；PCR-SSCP；產(chǎn)羔數(shù)

中圖分類號 S826 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0087-03

The Relationship between GDF9 Gene Polymorphism and Lambing Performance in the Hu Sheep

GU Zhurong，GUO Haiyan ，WANG Qiang et al （Animal Science and Technology College，Yangzhou University，Key Laboratory for Animal Genetic，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract [Objective]To study the relationship between GDF9 gene polymorphism and lambing performance in the Hu sheep.[Method]Hu sheep's GDF9 gene polymorphism was detected by PCRSSCP.The effect of polymorphism on the lambing performance of Hu sheep was analyzed.[Result] Three genotypes were detected and defined as GG，AG，AA.Genotype sequencing showed that the base A was replaced by base G at 152bp.GG genotype frequency，AG genotype frequency and AA genotype frequency were calculated， and the results were 0.107，0.883 and 0.010.The average number of two litters of GG，AG，AA genotypes were 2.068，2.025 and 1.500，respectively.The three genotypes had no effect on the first litter size.There was significant difference between GG，AG and AA in second litter and the GDF9 gene had an effect on the second litter size.From the average number of two litters，the results of variance analysis were not significant，but it also could be seen from the date that the number of litter size of GG and AG genotypes was relatively higher than litter size of AA genotypes.[Conclusion]GDF9 gene is necessary for normal breeding of sheep，and it has a certain effect on the litter size of Hu sheep.

Key words Hu sheep；GDF9 gene； PCRSSCP；Litter size

我國綿羊產(chǎn)業(yè)相對發(fā)達(dá)，綿羊業(yè)高產(chǎn)的原因之一便是其產(chǎn)羔的多胎性，其中湖羊的產(chǎn)羔性狀較優(yōu)，平均每年可產(chǎn)1～2胎，每胎產(chǎn)羔2～3只，有最高1胎產(chǎn)5只的記載[1-4]。湖羊的繁殖性狀是由多種基因共同調(diào)控的數(shù)量性狀，育種時(shí)較難對這一類性狀進(jìn)行有效的控制。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們可以利用分子標(biāo)記、PCR擴(kuò)增、DNA測序等技術(shù)對湖羊繁殖性狀起主要作用的基因進(jìn)行研究。

生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）被歸類為TGFβ（transforming growth factor β ）超家族成員，也有學(xué)者稱其為FecG基因，在卵母細(xì)胞分泌的眾多生長因子中，它是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)并相繼被許多學(xué)者研究的對象[5-8]。其在人和綿羊上定位于5號染色體，在牛上定位于7號染色體，在小鼠上定位于11號染色體，在大鼠上定位于10號染色體，可編碼400多個(gè)氨基酸[9-10]，對早期卵泡的生長發(fā)育有明顯的調(diào)節(jié)作用[11]。對湖羊和負(fù)鼠的研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因在子宮、輸卵管、卵巢等繁殖相關(guān)組織中均有較高表達(dá)，產(chǎn)仔數(shù)高的卵巢mRNA表達(dá)水平也較產(chǎn)仔數(shù)少的顯著，說明GDF9基因與卵泡形成及高繁殖力性狀間聯(lián)系密切[12-14]。對 GDF9基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，分別有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在1 184 bp有C→T的突變，在729 bp有G→T的突變，在152 bp有A→G的突變，在790 bp有C→A的突變，分析發(fā)現(xiàn)多種突變對母羊的排卵數(shù)都有顯著的促進(jìn)作用[15-17]。還有研究顯示，GDF9基因的2個(gè)突變可以顯著提高宗地花豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)以及仔豬初生重[18]。殷昆侖等[19]對GDF9基因在不同品系小鼠中的多態(tài)性分析時(shí)，第1次發(fā)現(xiàn)BALB/c和ICR 這2種小鼠GDF9基因的5′ UTR和所編碼的蛋白成熟區(qū)位點(diǎn)存在多態(tài)性，判斷GDF9基因與小鼠的繁殖力密切相關(guān)。顏泉梅等[20]也在對西農(nóng)奶山羊和波爾山羊的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)GDF9基因存在多態(tài)性，且產(chǎn)仔數(shù)AA基因型極顯著高于AG、GG基因型，顯然GDF9基因?qū)ρ芯繉ο蟮漠a(chǎn)羔性能存在著未知的必然影響。許多研究都證實(shí)了GDF9基因是動物高產(chǎn)仔數(shù)的主要作用基因之一。

筆者對湖羊GDF9基因進(jìn)行多態(tài)性檢測，并分析多態(tài)性對湖羊產(chǎn)羔性能的影響，為湖羊品種的選育工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集 供度樣品來自江蘇漣水縣紅業(yè)山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社，選取已有2胎生產(chǎn)記錄的206只湖羊。分批次對206只湖羊進(jìn)行頸靜脈采血，每只采集血液3 mL左右，并相應(yīng)記錄其耳標(biāo)號。用一次性采血盛血器采血，每次采血前在一次性采血盛血器中加入ACD抗凝劑。將采集的血樣暫時(shí)存放冰盒內(nèi)運(yùn)輸，后放在4 ℃環(huán)境下保存，提取DNA。

1.2 血樣DNA提取 DNA提取方法參照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒說明書，提取的DNA在-20 ℃環(huán)境下保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增、酶切及檢測 根據(jù)Bodensteiner等[13]報(bào)道的綿羊GDF9基因全序設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為上游引物： 5′-TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG-3′；下游引物： 5′-GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT-3′。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中血樣提取物1 μg，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×12.5 μL Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，再用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性60 s，引物57 ℃復(fù)性90 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠檢測，4 ℃環(huán)境下保存。

1.4 SSCP多態(tài)性檢測 取PCR產(chǎn)物2 μL和上樣緩沖液[98%甲酰胺、10%甘油、0.025%溴酚藍(lán)、10 mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025%二甲苯青]5 μL于PCR管內(nèi)，98 ℃變性10 min后迅速放入冰中5 min，可保持其變性狀態(tài)。在14%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=29∶1）中進(jìn)行電泳檢測，結(jié)束后用銀染法顯帶。

1.5 DNA測序 將提取的血樣DNA樣本送到無錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序及基因型鑒定，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和結(jié)果分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 收集整理試驗(yàn)樣本（湖羊）的生產(chǎn)記錄，計(jì)算湖羊GDF9不同基因型及基因型頻率。用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，對不同GDF9基因型的湖羊產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行Duncan方差分析，比較不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 將湖羊基因組用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物再進(jìn)行瓊脂糖（3%）凝膠電泳檢測，結(jié)果表明（圖1）：目的條帶為162 bp左右，其大小符合預(yù)期，特異性良好，能直接進(jìn)行下一步SSCP分析。

2.2 SSCP檢測結(jié)果 用引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做SSCP檢測，結(jié)果表明（圖2）：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)了3種基因型，判定GDF9基因在此次試驗(yàn)中存在多態(tài)性，將這3種基因型定義為GG、AG和AA型。從圖中看出GG基因型泳道是8、9、10；AG基因型泳道是1、2、3、4；AA基因型的泳道是5、6、7。

2.3 湖羊GDF9基因及基因型測定結(jié)果 經(jīng)生物公司測定，送檢湖羊樣本的GDF9基因存在多態(tài)性，共有3種基因型，將其分別定義為GG、AG、AA型。206個(gè)有效樣本中有22個(gè)為GG基因型，182個(gè)為AG基因型，2個(gè)為AA基因型。計(jì)算GG基因型頻率、AG基因型頻率和AA基因型頻率，結(jié)果分別為0.107、0.883和0.010，等位基因G的頻率為0.917，等位基因A的頻率為0.083。GG、AG和AA基因型第1、2胎的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為2.068、2.025和1.500。

2.4 GDF9基因不同基因型測序結(jié)果 為確定GDF9基因的突變位點(diǎn)，將3種基因型的PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果表明（圖3）：在152 bp處發(fā)生了A→G的突變（A152G）。

2.5 湖羊GDF9基因不同基因型頻率及產(chǎn)羔數(shù) GDF9基因不同基因型湖羊產(chǎn)羔數(shù)見表1。湖羊GG、AG、AA這3種基因型第1胎產(chǎn)羔數(shù)和第1、2胎平均產(chǎn)羔數(shù)均為差異不顯著（P>0.05）。第2胎的分析結(jié)果為GG、AG與AA基因型產(chǎn)羔數(shù)差異顯著（P<0.05），而GG與AG基因型產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P>0.05），從數(shù)據(jù)中可以看出，GG和AG基因型的產(chǎn)羔數(shù)相對AA基因型較高。

3 討論與結(jié)論

繁殖育種學(xué)家在很早以前便廣泛關(guān)注了羊的多胎性，對可能與這一性狀相關(guān)的基因也進(jìn)行了分子水平上的研究。2004年，國外學(xué)者曾經(jīng)對Belclare和Cambridge這2個(gè)綿羊品種GDF9基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在這2種綿羊染色體上都發(fā)生了突變，并且發(fā)現(xiàn)GDF9基因突變的方式與BMP15失活突變十分類似。進(jìn)一步分析結(jié)果表明：攜帶純合子的母羊表現(xiàn)不育，而攜帶雜合子的母羊排卵數(shù)明顯提高。此次研究說明GDF9基因?qū)d羊正常的繁殖是必需的[15]。李碧俠等[16]在陶賽特、湖羊、薩?？司d羊這3個(gè)品種中都發(fā)現(xiàn)了GDF9基因的cDNA第152 bp處有A→G的轉(zhuǎn)換，但在湖羊中只檢測到雜合子，而對研究的基因和產(chǎn)羔率之間的相互關(guān)系并未闡述。周澤曉等[17]在貴州山羊GDF9基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性研究中，檢測到外顯子2的790 bp處存在突變而導(dǎo)致的多態(tài)性，認(rèn)為此基因?qū)F州白山羊的繁殖力有影響，且推測與綿羊繁殖性能的方式相似。許多學(xué)者的研究都表示GDF9基因與動物的繁殖性能有很大的聯(lián)系，但也有些學(xué)者得到了相反的結(jié)果，路立里等[21]在對哈薩克羊GDF9基因的PCR-RFLP多態(tài)性研究時(shí)就沒有發(fā)現(xiàn)此基因存在多種基因型，GDF9基因?qū)_克羊的繁殖性能沒有調(diào)控作用。吳麗麗等[22]也曾對湖羊GDF9基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明GDF9基因與湖羊的多胎性狀沒有相互關(guān)系。

該試驗(yàn)的樣本數(shù)為206個(gè)，結(jié)果顯示湖羊GDF9基因存在多態(tài)性（GG、AG和AA），GG基因型頻率為0.107，AG基因型頻率為0.883，AA基因型頻率為0.010。對產(chǎn)羔數(shù)關(guān)系的分析結(jié)果顯示，3種基因型對第1胎產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著性影響，這可能與湖羊第1胎產(chǎn)羔數(shù)的不穩(wěn)定性有關(guān)系。第2胎GG、AG與AA之間有顯著性差異，表明GDF9基因?qū)虻漠a(chǎn)羔數(shù)有影響，試驗(yàn)結(jié)果有一定的參考價(jià)值。此次試驗(yàn)樣本太少，供試湖羊全部來自一個(gè)羊場，未經(jīng)選育，只有第1胎和第2胎的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，對試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。從第1、2胎的平均產(chǎn)羔數(shù)來看，雖然差異不顯著，但GG和AG基因型的產(chǎn)羔數(shù)相對AA基因型是比較高的，結(jié)合第2胎產(chǎn)羔數(shù)的分析結(jié)果，筆者認(rèn)為GDF9基因?qū)虻亩嗵バ源嬖谝欢ǖ挠绊?。如果要進(jìn)一步分析GDF9基因?qū)虍a(chǎn)羔性能的影響，需要增加樣本的檢測數(shù)量和采集地點(diǎn)，獲得更多的產(chǎn)羔胎次數(shù)，并聯(lián)合多個(gè)基因來進(jìn)一步分析GDF9和湖羊產(chǎn)羔數(shù)的相互關(guān)系。

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