小檗堿對(duì)小麥誘抗及發(fā)育的影響及其復(fù)方水劑的制備

孫睿,李朋鈺,延冬,師建華,葛喜珍

摘要 [目的]探討植物源農(nóng)藥小檗堿對(duì)小麥的生長的影響及其復(fù)方水劑配方。[方法]采用梯度稀釋法、土壤培育方法、單因素篩選法、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法等研究小檗堿對(duì)小麥誘抗及發(fā)育的影響及其復(fù)方水劑的制備。[結(jié)果]施用小檗堿防治小麥枯萎病時(shí)，土壤中安全施用小檗堿濃度為0.4～4.0 g/kg。小檗堿復(fù)方水劑配方為小檗堿0.000 1%、山豆根3%、吐溫-80 5%、木質(zhì)素磺酸鈣2%、山梨酸鉀0.25%、水楊酸0.25%、尿素1.1%、有機(jī)硅消泡劑（硅油）2%、滲透劑T 2%。[結(jié)論]在施用植物源農(nóng)藥小檗堿治療小麥枯萎病時(shí)，應(yīng)控制其在土壤中的濃度低于4 g/kg。復(fù)方水劑制備時(shí)，應(yīng)加入多種助劑使其穩(wěn)定性更高。

關(guān)鍵詞 小檗堿；山豆根；水劑；分解率；流點(diǎn)

中圖分類號(hào) S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）06-0126-04

Effects of Berberine on Induced Resistance and Development of Wheat and Preparation of Mixture

SUN Rui，LI Pengyu，YAN Dong et al （College of Biochemical Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023）

Abstract [Objective] The aim was to explore effects of berberine on induced resistance and development of wheat and preparation of mixture.[Method] Effects of berberine on induced resistance and development of wheat and preparation of mixture were studied by gradient dilution method，soil cultivation method，single factor screening method，orthogonal test design method，and so on.[Result] The concentration of berberine in the soil for controlling wheat wilt was 0.4-4.0 g/kg.The formula of berberine compound water agent was as followed：berberine 0.000 1%，mountain bean root 3%，Tween80 5%，lignosulfonate 2%，potassium sorbate 0.25%，salicylic acid 0.25%，urea 1.1%，organic silicon defoamer （silicone oil） 2%，penetrant T 2%.[Conclusion] The application concentration of berberine in the treatment of wheat wilt should be less than 4 g/kg in the soil.Preparation of complex water agent should be added a variety of additives to make it more stable.

Key words Berberine；Soybean root；Water agent；Decomposition rate；Flow point

小麥種植產(chǎn)量高，栽培面積大。小檗堿對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金葡菌、鏈球菌、傷寒桿菌及阿米巴原蟲有抑制作用[1]。李美狄等[2]研究了鹽酸小檗堿對(duì)綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對(duì)綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長具有促進(jìn)作用。

山豆根（Euchresta japonica），名黃結(jié)、柔枝槐、苦豆根，還有稱其為廣豆根等，藥性苦，寒，有毒。歸肺、胃經(jīng)。功效清熱解毒，利咽消腫，現(xiàn)代臨床應(yīng)用于治療咽喉、牙齦腫疼、心血管系統(tǒng)疾病、癌癥等[2]。根據(jù)北豆根提取物劑型的研究進(jìn)展[3]，山豆根的制備有以下劑型：北豆根片、北豆根膠囊、北豆根軟膠囊、北豆根口腔崩解片、北豆根分散片、膠體溶液、經(jīng)皮給藥等。目前，關(guān)于小檗堿與山豆根的復(fù)方水劑劑型的研究鮮見報(bào)道。鑒于此，筆者研究了小檗堿對(duì)小麥誘抗及發(fā)育的影響，并探討了小檗堿與山豆根復(fù)方水劑的制備，旨在為生物源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的創(chuàng)制和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 10∶1山豆根，陜西天之潤生物科技有限公司；98%硫酸小檗堿，陜西天之潤生物科技有限公司；順丁烯二酸二仲辛酯磺酸鈉（快速滲透劑T），山東優(yōu)索化工科技有限公司；有機(jī)硅消泡劑，山東臨沂魯南化工研究所；木質(zhì)素磺酸鈣，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；山梨酸鉀，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；水楊酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；尿素，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；吐溫-80，北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1 小檗堿在土壤中對(duì)小麥發(fā)芽生長的最低抑制濃度試驗(yàn)。選取顆粒飽滿、大小一致的小麥種子播種在小檗堿濃度為10.000 00、1.000 00、0.100 00、0.001 00、0.000 01 g/kg的花盆土壤中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，每盆15粒種子，播種后觀察并記錄其出芽個(gè)數(shù)及出芽高度。根據(jù)第1次試驗(yàn)結(jié)果得出的濃度設(shè)定3個(gè)系列濃度，進(jìn)一步確定最低抑制濃度。同上重復(fù)試驗(yàn)步驟，繪制濃度曲線，確定最低抑制濃度。

1.2.2 小檗堿與山豆根復(fù)方水劑的制備。

1.2.2.1 分散劑的篩選。將各種分散劑分別配成統(tǒng)一百分比的水溶液，用超聲波清洗器使其全部溶解，稱量100 mL小燒杯，向其中加入3 g山豆根超細(xì)粉，用膠頭滴管慢慢滴加配制好的分散劑水溶液。滴加分散劑供試液的同時(shí)觀察粉末是否能形成自由滴落的水滴式液體，不斷攪拌并記錄滴加供試液的質(zhì)量，重復(fù)6次，用如下公式計(jì)算分散劑對(duì)供試原藥的流點(diǎn)：

分散劑對(duì)原藥的流點(diǎn)=滴加5%分散劑水溶液質(zhì)量/供試原藥的質(zhì)量

1.2.2.2 防凍劑的篩選。取250 mL山豆根小檗堿水劑的試樣置于250 mL錐形瓶中，在制冷器中冷卻至溫度為-2～2 ℃，先放置1 h，期間每15 min攪拌1次，每次20 s，觀察表面是否有顆粒物或溶劑析出。將燒杯放回制冷器，繼續(xù)放置7 d，取出，置于室溫下待其融化，測試懸浮率指標(biāo)[4]。

1.2.2.3 防腐劑的篩選。以山梨酸鉀、水楊酸作為防腐劑添加對(duì)象，在不同的添加量下，分別測定有效成分山豆根的分解率。采用紫外分光光度計(jì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用吸光度確定主要成分的含量變化。確定防腐劑的品種，再進(jìn)一步確定防腐劑的最佳含量[5]。

1.2.2.4 表面活性劑的篩選。在250 mL三角瓶中分別將NP-15、OP-10、吐溫-80 3種表面活性劑配制成系列濃度，按國家標(biāo)準(zhǔn)GB5549—1990的方法，用界面張力儀測定相應(yīng)濃度溶液的表面張力。在28 ℃左右下，1個(gè)樣品平行測量6次，得到平均值，使其乘以校正因子，乘積值為實(shí)際表面張力。為了使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，測定加有表面活性劑的原藥的懸浮率[6]。

懸浮率（%）=111×（C-Q）C

式中，Q為在底部25 mL的質(zhì)量，g；C=W×A/100，為在整個(gè)量筒中的質(zhì)量（g），其中W為加入量筒中的制劑的質(zhì)量（g），A為劑型中含有質(zhì)量的百分率。

1.2.2.5 消泡劑的篩選。取混合劑各20 mL，置于直筒刻度搖瓶中，水浴加熱至70 ℃，上下?lián)u蕩15次，靜置，記錄加入消泡劑的質(zhì)量、原液泡沫高度、消泡高度和消泡率。

1.2.2.6 滲透劑的篩選。配制含有10%表面活性劑的小檗堿山豆根水劑，分別加入占原液比例0.5%、1.0%、2.0%的滲透劑GFC和0.5%、1.0%、2.0%的滲透劑T于葉片上進(jìn)行展布試驗(yàn)，記錄滲透劑展開直徑。亦可采用帆布法進(jìn)行試驗(yàn)，該試驗(yàn)采取這種方法。

1.2.2.7 正交試驗(yàn)測定各穩(wěn)定劑最佳含量。由于表面活性劑、分散劑、防腐劑、防凍劑在單因素篩選過程中對(duì)主成分的影響相對(duì)較大，故設(shè)計(jì)為4個(gè)因素，進(jìn)一步精準(zhǔn)地確定最佳用量。而滲透劑和消泡劑對(duì)原液影響較小，易確定用量，故設(shè)計(jì)為2個(gè)因素。加之1組空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿在土壤中對(duì)小麥發(fā)芽生長的最低抑制濃度 由圖1可知，第4天之后的出芽顆數(shù)方差（≤0.97）均不大，可以明顯看出當(dāng)土壤中小檗堿濃度小于8.0 g/kg時(shí)，植物源農(nóng)藥小檗堿對(duì)小麥出芽并無影響，但隨小檗堿濃度增大，小麥株高降低。當(dāng)小檗堿濃度大于4.0 g/kg時(shí)，小檗堿對(duì)小麥出芽具一定的抑制作用。故高濃度小檗堿對(duì)小麥生長有影響，濃度過高可抑制小麥種子的萌發(fā)。在施用植物源農(nóng)藥小檗堿防治小麥枯萎病時(shí)土壤中小檗堿濃度應(yīng)低于4.0 g/kg。

2.2 低溫穩(wěn)定性測試 由表1可知，乙二醇在攪拌過程中有不穩(wěn)定溶劑析出，再根據(jù)凝固百分比試驗(yàn)將其排除。由表2可知，添加尿素的供試液懸浮率最高，說明經(jīng)過幾天的低溫貯藏，供試液中雖然有沉降的溶劑，但仍然比原液的懸浮率高，起到了一定的穩(wěn)定作用。故排除丙三醇，選擇尿素作為防凍劑。

2.3 分散劑的篩選結(jié)果 由圖2可知，木質(zhì)素磺酸鈣的流點(diǎn)較低，且含有對(duì)植物有益的鈣元素，鈉元素對(duì)土壤有一定程度的破壞，故選擇木質(zhì)素磺酸鈣作為濕潤分散劑。

2.4 防腐劑的篩選結(jié)果

2.4.1 產(chǎn)生絮狀物情況。將0.5%的防腐劑水楊酸、山梨酸鉀分別置入100 mL 3%小檗堿山豆根復(fù)配水劑中，全部溶解后置于常溫培養(yǎng)箱中，每天記錄外觀變化，第19天測量其水溶液中山豆根含量，加之空白原液對(duì)比，得最佳防腐劑。原液在第7天產(chǎn)生了大面積絮狀物，表面有菌落。添加水楊酸的供試液在第18天有少量絮狀物，表面無菌落。加有山梨酸鉀的供試液在19 d中一直保持無絮狀物、無沉淀、無菌落的表面特征。故以山梨酸鉀作為防腐劑。

2.4.2 紫外測量山豆根含量情況。由于山豆根屬于中藥，其主要成分復(fù)雜，紫外分光光度計(jì)無法測定其主成分的含量，故測量山豆根中黃酮成分的含量。具體操作方法參照山豆根中總黃酮的含量測定[7]。取5 mL標(biāo)準(zhǔn)液定容至50 mL，取1 mL定容后的液體于50 mL容量瓶中，加入1.2 mL 5% NaNO2，放置6 min，再加入2 mL 10%Al（NO3）3放置6 min，加入20 mL 4% NaOH，用60%乙醇定容。15 min后測量。

由圖3可知，山梨酸鉀與水楊酸的吸光度差距不大，且均比原液的吸光度大，可見加入防腐劑的供試液主成分的分解率降低。故水楊酸和山梨酸鉀均可作為防腐劑。

2.5 表面活性劑的篩選結(jié)果 由圖4可知，加入吐溫-80的供試液懸浮率較高，且吐溫-80相比其他2種表面活性劑更易溶于水，故選擇吐溫-80作為最佳表面活性劑。

2.6 消泡劑的篩選結(jié)果 由圖5可知，乙醇和有機(jī)硅消泡劑的消泡率相近，無法篩選出最佳消泡劑。但常溫時(shí)攪拌加有乙醇的供試液時(shí)表面有泡沫，當(dāng)加熱至70 ℃時(shí)表面泡沫消失，故篩選出有機(jī)硅消為最佳消泡劑。

2.7 滲透劑的篩選結(jié)果 滲透劑T有少量氣味，易溶于水。滲透劑JFC無氣味但難溶于水。由圖6可知，滲透劑T與滲透劑JFC的滲透效果相同，故以易溶于水的滲透劑T作為最佳滲透劑。

2.8 復(fù)配水劑正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，滲透劑的影響最大，其次是表面活性劑、防腐劑、防凍劑、消泡劑、分散劑。最佳復(fù)配方案為表面活性劑5%、分散劑2%、防腐劑0.5%、防凍劑1.1%、消泡劑2%、滲透劑2%、小檗堿0.000 1%、山豆根3%，用水定容至100%。

3 結(jié)論與討論

小檗堿對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金葡菌、鏈球菌、傷寒桿菌及阿米巴原蟲有抑制作用，也有研究將小檗堿用于農(nóng)用殺菌劑[8]。該研究表明，在土壤中安全施用小檗堿濃度為0.4～4.0 g/kg，種子的生長受較多因素影響，其具體的系統(tǒng)機(jī)理需進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)研究了田間農(nóng)藥小檗堿含量的濃度范圍，對(duì)其應(yīng)用于農(nóng)作物尤其是小麥有一定的指導(dǎo)意義。

該研究表明，小檗堿和山豆根的復(fù)方水劑的最佳配方為小檗堿0.000 1%、山豆根3%、吐溫-80 5%、木質(zhì)素磺酸鈣2%、山梨酸鉀0.25%、水楊酸0.25%、尿素1.1%、有機(jī)硅消泡劑2%、滲透劑T 2%、水84.399 9%。今后需進(jìn)一步研究該水劑的穩(wěn)定性、藥效產(chǎn)率及其對(duì)大田農(nóng)作物的功效，為生物源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的創(chuàng)制和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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