高效生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)優(yōu)化

陳成,劉人榮,夏祥,邱成書,謝翼飛,陳存

摘要 [目的]篩選和優(yōu)化高效生物絮凝劑產(chǎn)生菌。[方法]從活性污泥中分離篩選得到1株高活性的生物絮凝劑產(chǎn)生菌株B17，從生理生化特征、形態(tài)特征等方面對該菌進(jìn)行初步鑒定，采用單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)時間、碳源、氮源、碳氮比、初始pH 、接種量等培養(yǎng)條件。[結(jié)果]B17為克雷伯氏菌屬（Klebsiella SP.）。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為乳糖，氮源為乙酸銨，碳氮比為20∶1，發(fā)酵初始pH 為6.0～7.0，接種量為3%，在該最優(yōu)組合的發(fā)酵條件下以30 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，絮凝活性可提高25.0%～38.3%。[結(jié)論]該研究可為篩選高效的絮凝劑產(chǎn)生菌、優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件、提高絮凝劑的活性提供借鑒。

關(guān)鍵詞 生物絮凝劑；培養(yǎng)條件；克雷伯氏菌

中圖分類號 S181 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0052-03

Screening and Culture Optimization of a Highefficiency Bioflocculantproducing Strain

CHEN Cheng1，LIU Renrong1，XIA Xiang2 et al （1.School of Chemistry and Life Science，Chengdu Normal University，Chengdu，Sichuan 611130；2.Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu，Sichuan 610041）

Abstract [Objective]To screen and optimize high efficiency bioflocculant producing bacteria.[Method]Screening of a high activity bioflocculant producing strain B17 was isolated from activated sludge，a preliminary identification of the bacteria was carried out from the physiological and biochemical characteristics，morphological characteristics，using the single factor experiment to optimize incubation time，carbon source，nitrogen source and carbon nitrogen ratio，initial pH，inoculation amount of culture conditions.[Result]B17 was identified as Klebiella SP..Lactose was the optimum carbon source，ammonium acetate was the most optimal nitrogen source，the ratio of carbon to nitrogen（C/N） in the culture broth was at 20∶1，the optimal initial pH was about the scope of 6.0-7.0，and inoculum size was about 3% the highest flocculating activity was obtained.inoculum size 3%，culture temperature 30 ℃，shaking speed 160rpm and incubation time 24 hours.Under the optimum culture conditions，the final flocculating were increased by 25%-38.3%.[Conclusion]This study can be used for reference for screening highly efficient flocculant producing bacteria，optimizing the culture conditions of strains and improving the activity of flocculants.

Key words Bioflocculant；Culture conditions；Klebsiella SP.

生物絮凝劑是天然高分子絮凝劑中的重要組成部分，是一種通過微生物發(fā)酵、分離提取而得到的新型污水處理劑[1]，與傳統(tǒng)的鋁鹽、鐵鹽絮凝劑相比，生物絮凝劑安全無毒、易于降解、高效且無二次污染 [2-4]，可用于多種水體的處理[4-7]，有著廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，生物絮凝劑在我國引起了研究開發(fā)者的重視，但目前多數(shù)處于菌種的篩選階段，市場上生物絮凝劑的價格較化學(xué)絮凝劑昂貴。不同菌種產(chǎn)生的絮凝成分差別較大，而不同培養(yǎng)條件也會對絮凝效果和產(chǎn)量產(chǎn)生較大影響[7-10]。因此，篩選高效的絮凝劑產(chǎn)生菌、優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件、提高絮凝劑的活性具有重要的現(xiàn)實意義。該研究從活性污泥中篩選出1株高效絮凝劑產(chǎn)生菌，對其進(jìn)行初步鑒別，并對其在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的絮凝劑活性進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料 活性污泥取自成都某污水處理廠，培養(yǎng)基中使用的化學(xué)試劑NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2等均為分析純。

分離培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，pH 7.2～7.4，自來水1 L，于121 ℃滅菌20 min。種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，K2HPO4 5 g，KH2PO4 2 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，pH 7.2～7.5，自來水1 L，于121 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基相同。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化。將100 mL無菌水和玻璃珠裝入已滅菌的250 mL三角瓶中，然后把采集到的10 g活性污泥樣品放入三角瓶中。為了使樣品充分分散于水中，將三角瓶放在搖床上振蕩2 h，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為200 r/min，靜置20 min后，進(jìn)行倍比稀釋。無菌操作吸取0.1 mL各稀釋度的樣品懸濁液于各分離培養(yǎng)基上，用無菌玻璃刮刀旋轉(zhuǎn)涂布均勻，30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

通過觀察分離得到的菌落，把具有不同菌落特征的菌株挑出，并在平板上反復(fù)劃線培養(yǎng)純化。最終，把純化得到的單菌落轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基上，于4 ℃保存，備用。

1.2.2 絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定。在保存的種子菌株斜面上取一環(huán)，接至裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，放置在恒溫?fù)u床培養(yǎng)，搖床溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)方法：按5%的接種量將種子培養(yǎng)液接入裝有250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于30 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。

一般用于絮凝法處理的顆粒直徑的上限為 10 μm，根據(jù)斯托克斯的公式，直徑為 10 μm 的顆粒在水中的自然下沉所需要時間為每 1 m 水深大于100 min[11]，因此用高嶺土懸濁液代替廢水進(jìn)行絮凝試驗具有很好的代表性。取1 mL絮凝劑液體加入1.25 mL CaCl2，再加入20 mL（5 g/L）高嶺土懸液攪拌混勻，室溫放置5 min，在550 nm處測量吸光值。

對菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，確定絮凝效果較好的菌株。采用Olympus生物顯微鏡及成像系統(tǒng)對篩選出來的菌種形態(tài)特征進(jìn)行觀察，并參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，結(jié)合生理生化試驗進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 高效絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)優(yōu)化。測定篩選出來的菌株種齡對生長的影響，開始每2 h取樣，用分光光度計測定550 nm處的吸光值，6 h后每間隔1 h取樣，繪制生長曲線。采用單因素試驗方法，以最優(yōu)培養(yǎng)時間，分別改變其培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（不同碳源、氮源及碳氮比）、培養(yǎng)基pH、接種量等，在30 ℃ 160 r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。對高嶺土懸濁液進(jìn)行絮凝試驗，在分光光度計550 nm處測定絮凝率，600 nm處測定菌體的濁度，優(yōu)化絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定 從樣品中共分離得到89種菌株，經(jīng)初篩得到19株對高嶺土懸濁液具有明顯絮凝活性的菌株，再經(jīng)過復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)編號為B17的菌株的發(fā)酵上清液對高嶺土懸液具有較強(qiáng)的絮凝能力，故選定B17為進(jìn)一步研究對象。該菌株為短桿狀、無鞭毛、有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，在固體培養(yǎng)基上呈半球狀乳白色菌落，邊緣平整、濕潤、黏稠、易挑起（圖1）。B17的主要生理生化試驗特征見表1，根據(jù)其菌落形態(tài)和生理生化特征，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，該菌初步鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella SP.）。

2.2 高效絮凝劑產(chǎn)生菌B17的培養(yǎng)優(yōu)化

2.2.1 生長曲線的繪制。 高效絮凝劑產(chǎn)生菌B17菌體的生長狀況隨著培養(yǎng)時間的變化規(guī)律見圖2。由圖2可知，0～4 h，菌體處于適應(yīng)期，菌體數(shù)目基本不增加。4～11 h菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，該時期菌體快速增殖，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)迅速被消耗。12～15 h菌體進(jìn)入穩(wěn)定期；15 h后菌體進(jìn)入衰亡期。衰亡期種子液的濁度增加可能是由于菌體進(jìn)入后期營養(yǎng)物質(zhì)幾乎被消耗完，導(dǎo)致菌體衰亡、裂解，釋放菌體內(nèi)容物，從而使?jié)岫仍黾?。因此，選擇培養(yǎng)10 h的種子液作為后續(xù)接入發(fā)酵液的培養(yǎng)時間。

2.2.2 碳源優(yōu)化。分別以1%葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸、甘露糖和乙醇作為碳源，在種子培養(yǎng)液培養(yǎng)10 h后接入發(fā)酵液，在30 ℃ 160 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，于550 nm處測定絮凝活性和600 nm處測定菌體量，結(jié)果見圖3。OD550值越小，上清液越澄清，發(fā)酵液絮凝效果越好；OD600數(shù)值越高，表明發(fā)酵液中菌種生長狀況越好。由圖3可知，乳糖為碳源的發(fā)酵液OD550值為0.059，對高嶺土懸液的絮凝活性最好；OD600為0.582，菌體量相對較高。與以葡萄糖為碳源的原始培養(yǎng)基相比，活性明顯增加，因此發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適碳源為乳糖。

2.2.3 氮源優(yōu)化。分別以1 g/L的乙酸銨、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨代替0.5 g/L尿素和0.5 g/L酵母膏優(yōu)化培養(yǎng)基氮源，對照為未添加氮源的培養(yǎng)基。碳源選擇為乳糖，接種時間為10 h的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)后測定絮凝劑活性和菌體量，結(jié)果見圖4。在以乙酸銨為氮源的情況下，其發(fā)酵液對高嶺土的絮凝效果最佳，OD550為0.090，菌體量OD600為0.557，較原培養(yǎng)基絮凝活性提高了約17%，又因絮凝劑的絮凝活性是評價其是否具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)，故選擇最佳氮源為乙酸銨。

2.2.4 碳氮比優(yōu)化。調(diào)節(jié)C/N比分別為2∶1、4∶1、8∶1、10∶1、20∶1、40∶1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對照為原培養(yǎng)基碳氮比。碳源為乳糖，氮源為乙酸銨。得到的絮凝產(chǎn)物和菌體活性見圖5。由圖5可知，當(dāng)碳氮比為20∶1時，對高嶺土的絮凝活性最高，OD550為0.048，菌體量較多，OD600為0.712。因此，菌體選擇最佳碳氮比為20∶1。

2.2.5 初始pH優(yōu)化。將培養(yǎng)液的初始pH調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到的絮凝產(chǎn)物和菌體活性見圖6。由圖6可知，在pH為6.0時，OD550為最低值，僅0.082，菌體量較多，OD600為0.233，而在pH為7.0時的OD550與OD600值與pH為6.0時相差不大。因此，培養(yǎng)液的最適pH為6.0～7.0，對高嶺土懸液的絮凝活性最高，可見B17號菌更適合在中性或者偏弱酸性的環(huán)境生長。

2.2.6 接種量優(yōu)化。按照1%、3%、5%、7%、10%、12%的接種量將種子液接入發(fā)酵液，在前面得到的優(yōu)化條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見圖7。圖7顯示，在接種量為3%時，絮凝活性最好，OD550值最低，且菌體量最高，比原接種量5%活性提高，因此選擇最佳接種量為3%。

3 結(jié)論

（1）該研究結(jié)果表明，生物絮凝劑的產(chǎn)生不僅取決于微生物營養(yǎng)的碳源、氮源、C/N等，還與培養(yǎng)時間、初始pH、接種量等有關(guān)。優(yōu)化后的B17培養(yǎng)條件：最適碳源為乳糖，氮源為乙酸銨，碳氮比為20∶1，發(fā)酵初始pH為6.0～7.0，接種量為3%，在此最優(yōu)組合的發(fā)酵條件下置于搖床（溫度30 ℃，160 r/min）中培養(yǎng)24 h，絮凝活性可提高25.0%～38.3%。

（2）從活性污泥中初篩和復(fù)篩得到絮凝活性較高的菌株B17，通過菌株的形態(tài)特征、生理生化試驗結(jié)果鑒定，確定該菌株為克雷伯氏菌屬（Klebsiella SP.）。

參考文獻(xiàn)

[1] 何寧，李寅，陳堅，等.生物絮凝劑的最新研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報，2005，32（2）：104-108.

[2] DENG S B，BAI R B，HU X M，et al.Characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosus and its use in starch wastewater treatment [J].Applied microbiology & biotechnology，2003，60（5）：588-593.

[3] 劉金亮，姜彬慧，趙鑫，等.一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌的分離和鑒定[J].東北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，37（5）：706-710.

[4] LIAN B，CHEN Y，ZHAO J，et al.Microbial flocculation by Bacillus mucilaginosus：Applications and mechanisms[J].Bioresource technology，2008，99（11）： 4825-4831.

[5] 陳熙，謝經(jīng)良，鞠建松，等.印染廢水高效脫色菌的研究[J].青島理工大學(xué)學(xué)報，2008，29（3）：66-69.

[6] 朱戀，王熳，張燦，等.多糖生物絮凝劑在酸性煤礦廢水處理中的應(yīng)用[J].給水排水，2013，39（S1）：327-330.

[7] 關(guān)正軍，王新志，楊一盈.藻類生物絮凝劑對沼液的絮凝效果研究[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2017，48（5）：290-295.

[8] 任宏洋，王新惠，劉達(dá)玉.復(fù)合菌利用醬油廢液制備生物絮凝劑及其絮凝特性分析[J].中國環(huán)境科學(xué)，2010，30（8）：1050-1055.

[9] 趙起政，路宏科，彭濤，等.馬鈴薯淀粉廢水高活性絮凝菌的分離鑒定[J].中國釀造， 2015，34（2）：76-81.

[10] LI Q，LIU H L，QI Q S，et al.Isolation and characterization of temperature and alkaline stable bioflocculant from Agrobacterium sp.M503[J].New biotechnology， 2010， 27（6）：789-794.

[11]張自杰，林榮忱，金儒霖.排水工程：下[M].北京：中國建筑工業(yè)出版社，2000：61-63.