基于NHS基團(tuán)修飾的副溶血性弧菌免疫磁珠制備及其富集性能評價(jià)

劉陽，劉文俠，孫力軍,施琦,邱妹,鄧旗

摘要 [目的]制備NHS基團(tuán)修飾的副溶血弧菌免疫磁珠并評價(jià)其富集性能。[方法]采用偶聯(lián)率確定免疫磁珠最佳制備條件（磁珠粒徑、偶聯(lián)時(shí)間和抗體加入量），采用捕捉率確定免疫磁珠最佳富集條件（菌懸液pH、孵育時(shí)間和免疫磁珠加入量），并通過方法的特異性、靈敏度、精密度和穩(wěn)定性評價(jià)免疫磁珠富集性能。[結(jié)果] 0.1 mL N2型NHS磁珠可與0.2 mL副溶血弧菌抗血清偶聯(lián)2 h制備IMBVP，加入到副溶血弧菌菌懸液（pH 7.0～7.4）中孵育2 h，IMBVP最佳工作液體積為0.4 mL。該方法特異性好、靈敏度高（15 cfu/50 mL）、精密度高（批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均在3%～6%）、穩(wěn)定性好（準(zhǔn)確度大于91%）。[結(jié)論]自制副溶血弧菌免疫磁珠富集性能好，方法工作效率高，成本低，為副溶血弧菌高效快速檢測提供了可靠的富集手段。

關(guān)鍵詞 NHS基團(tuán)；副溶血弧菌；免疫磁珠；富集

中圖分類號 S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0001-04

Preparation of Vibrio parahaemolyticus Immunomagnetic Beads Based on NHS Group and Evaluation of Enrichment Capacity

LIU Yang1，LIU Wenxia1，SUN Lijun2 et al （1.National Marine Products Quality Supervision & Inspection Center，Zhanjiang，Guangdong 524000；2.College of Food Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract [Objective] The aim was to prepare Vibrio parahaemolyticus immunomagnetic beads （IMBVP） based on NHS group and evaluate the enrichment capacity.[Method] The best coupling conditions were decided by conjugate ratio，like conditions range from magnetic beads particle diameter，coupling time and the adding amount of antibody.The best enrichment conditions were decided by capture rates，like conditions range from pH，incubation time and the adding amount of IMBVP.The enrichment capacity of IMBVP was evaluated according to specificity，sensitivity，precision and stability.[Result] The IMBVP was prepared by chemical bond，which combined 0.1 mL of NHS bead with size N2 and 0.2 mL of Vibrio parahaemolyticus antiserum.IMBVP was placed into the bacterial suspension which pH was 7.0-7.4.Volume addition of was IMBVP 0.4 mL.They were incubation 2 h together.The method was involved in some advantages，high specificity，sensitivity and accuracy.The detection limit was 15 cfu/50 mL.The CVs of intra and inter assay were between 3% and 6%.The accuracy was greater than 91%.[Conclusion] The above results demonstrate that homemade IMBVP has good enrichment performance.Experiment results show that it is an effective method，convenience，low cost and quickness.

Key words NHS；Group Vibrio parahaemolyticus；Immunomagnetic beads；Enrichment

免疫磁珠分離技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)[1]。根據(jù)免疫學(xué)原理，副溶血性弧菌抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下與磁珠偶聯(lián)后，可與副溶血性弧菌發(fā)生特異性結(jié)合，在外加磁場的作用下，達(dá)到快速分離和富集目標(biāo)菌的效果。這種高特異性方法可以在較為復(fù)雜的環(huán)境中有效地收集、濃縮大量樣品中的少量目標(biāo)菌，從而提高檢測效率。目前，已有學(xué)者對副溶血性弧菌免疫磁珠的制備方法進(jìn)行了研究[2-4]，但存在3個(gè)問題：一是采用國外磁珠Dynabeads效果較好，但是價(jià)格昂貴，超出國內(nèi)磁珠價(jià)格10倍；二是常用磁珠類型為羧基磁珠或氨基磁珠，在連接抗體前需要對磁珠進(jìn)行活化，并且磁珠與抗體偶聯(lián)的時(shí)間較長，一般需要過夜，大大影響了免疫磁珠制備的效率；三是現(xiàn)有研究主要是對1 mL樣品液進(jìn)行富集，沒有體現(xiàn)免疫磁珠應(yīng)用優(yōu)勢。

基于以上問題，筆者選用NHS磁珠作為試驗(yàn)材料，與副溶血性弧菌抗血清偶聯(lián)制備免疫磁珠（IMBVP），優(yōu)化了免疫磁珠制備條件和孵育條件，確定了最佳制備和使用方案，并通過特異性、靈敏性和穩(wěn)定性試驗(yàn)對副溶血弧菌免疫磁珠富集性能進(jìn)行了評價(jià)，以期為構(gòu)建副溶血弧菌高效快速的檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 副溶血性弧菌（ATCC33847）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、溶藻弧菌（ATCC 17749）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、單增李斯特菌（ATCC 19115）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、沙門氏菌（CMCC50094）、志賀氏菌（CMCC51572）；NHS磁珠（HRCZ-03N300粒徑為300 nm，以下縮寫為“N1”、HRCZ-03N400粒徑為1 μm，以下縮寫為“N2”），洛陽惠爾納米科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠的制備。①取0.1 mL NHS磁珠，加入0.5 mL洗滌緩沖液（PBST：0.1 mol/L PBS溶液含0.05%吐溫-20，pH 7.4）洗滌3次，置于磁分離器中，去上清；②取副溶血弧菌K Ⅱ 型抗血清（以下簡稱“抗血清”）稀釋液，偶聯(lián)緩沖液（MEST：15 mmol/L MES，含0.05%吐溫-20，pH 6.0）調(diào)節(jié)體積至0.4 mL，混合液室溫振蕩反應(yīng)后，置于磁分離器取上清，檢測偶聯(lián)率。洗滌緩沖液洗滌3次，置于磁分離器中，去上清?？捡R斯亮藍(lán)測蛋白法測定上清液蛋白質(zhì)含量，計(jì)算抗體蛋白與磁珠偶聯(lián)率。③加入封阻緩沖液（PBST含 2% BSA）渦旋30 s，將離心管于室溫下振蕩反應(yīng)2 h；④洗滌后將制備好的免疫磁珠（IMBVP）存放于保存緩沖液（PBST含0.02%NaN3、1%BSA）中，4 ℃保存待用。

偶聯(lián)率=血清蛋白加入量-上清液蛋白剩余量血清蛋白加入量×100%

1.2.2 免疫磁珠對目標(biāo)菌株的捕獲。①將IMBVP去上清，加入1 mL副溶血性弧菌菌懸液，37 ℃振蕩反應(yīng)。②取0.1 mL上清液涂布弧菌顯色培養(yǎng)基，去其他上清液。③取0.5 mL洗滌緩沖液洗滌IMBVP 3次，置于磁分離器中，去上清。④加入0.3 mL PBST混勻后，分別取0.1 mL混合液涂布3個(gè)弧菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h計(jì)數(shù)，取3個(gè)板菌落數(shù)之和。計(jì)算原液菌落數(shù)和IMBVP捕獲菌落數(shù)，計(jì)算捕獲率。同時(shí)以無菌生理鹽水代替菌懸液作為陰性對照。

捕獲率（X）=富集到的菌落數(shù)（cfu/0.1 mL）原始菌落數(shù)（cfu/0.1 mL）×100%

1.2.3 磁珠制備條件的優(yōu)化。

1.2.3.1 磁珠型號。比較N1和N2 2種型號磁珠偶聯(lián)情況。

1.2.3.2 偶聯(lián)時(shí)間。磁珠與抗血清偶聯(lián)不同時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），比較偶聯(lián)率，確定最佳偶聯(lián)時(shí)間。

1.2.3.3 抗體加入量。分別比較不同含量抗血清（0.1、0.2、0.3、0.4 mL ）與磁珠的偶聯(lián)率，確定最佳血清加入量。

1.2.4 免疫磁珠捕獲目標(biāo)菌條件的優(yōu)化。

1.2.4.1 捕獲時(shí)間。比較免疫磁珠與目標(biāo)菌在不同孵育時(shí)間情況下（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h）對目標(biāo)菌的捕獲率，確定IMBVP捕獲目標(biāo)菌最佳時(shí)間。

1.2.4.2 孵育溶液pH。比較不同孵育環(huán)境中（pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）免疫磁珠對目標(biāo)菌的捕獲情況。

1.2.4.3 免疫磁珠使用量。比較不同含量IMBVP（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL）對等濃度目標(biāo)菌的捕獲率，確定最佳免疫磁珠使用量。

1.2.5 免疫磁珠捕獲性能的測定。

1.2.5.1 特異性。采用IMBVP分別分離副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、志賀氏菌，對于副溶血性弧菌疑似菌落進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)，比較IMBVP對不同菌株的富集情況，評價(jià)其特異性。

1.2.5.2 靈敏性。將IMBVP分別加入到等濃度、不同體積的副溶血性弧菌菌懸液中（1、10、50 mL）進(jìn)行富集檢測。設(shè)置傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法作為對照試驗(yàn)。計(jì)算捕捉率確定IMBVP檢測副溶血性弧菌的最低檢測限。

1.2.5.3 精確度。將IMBVP分別加入濃度范圍為<30 cfu和30～300 cfu副溶血弧菌菌懸液中，最佳條件下進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)（n=5），以其批內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差，批間變異系數(shù)表示批間誤差，系數(shù)范圍在低濃度點(diǎn)時(shí)應(yīng)<15%。2個(gè)變異系數(shù)表示方法的精確程度。

1.2.5.4 準(zhǔn)確度。計(jì)算多次試驗(yàn)（n=15）結(jié)果準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度（%）=1-E%。其中E%表示測定結(jié)果的相對誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠制備最佳條件的確定

2.1.1 磁珠型號對磁珠偶聯(lián)能力的影響。采用2個(gè)型號免疫磁珠加入到等濃度的副溶血弧菌菌懸液中，N1型和N2型免疫磁珠對副溶血弧菌的捕捉率為（50.27±2.39）%和（74.23±1.77）%。因此，確定N2型磁珠作為后續(xù)試驗(yàn)磁珠，由N2型磁珠制備的免疫磁珠為IMBVP。

2.1.2 偶聯(lián)時(shí)間對磁珠偶聯(lián)能力的影響。結(jié)果表明，時(shí)間對偶聯(lián)率的影響較大。隨著磁珠與抗血清偶聯(lián)時(shí)間的延長，磁珠結(jié)合抗血清的能力增強(qiáng)，偶聯(lián)2 h后偶聯(lián)率達(dá)到最大值（79.73±0.79）%（圖1）。超過2 h后，磁珠與抗血清偶聯(lián)率變化幅度較小，并有微弱的降低。這說明長時(shí)間的振蕩會影響磁珠與抗血清的化學(xué)鍵結(jié)合。因此，選取2 h為磁珠與抗血清偶聯(lián)最佳時(shí)間。

2.1.3 磁珠對抗血清承載量的確定。結(jié)果表明，磁珠對抗血清具有一定的承載能力。隨著抗血清含量增加，與磁珠偶聯(lián)趨于穩(wěn)定，當(dāng)抗血清添加量為0.2 mL時(shí)，偶聯(lián)率最高可達(dá)（90.82±1.79）%（圖2）。當(dāng)超過磁珠承載量后，溶液中沒有結(jié)合的血清含量增多，偶聯(lián)率下降，浪費(fèi)材料。因此，確定0.1 mL NHS磁珠可與0.2 mL抗血清進(jìn)行偶聯(lián)制備IMBVP。

2.2 免疫磁珠捕獲目標(biāo)菌株最佳條件的確定

2.2.1 捕獲時(shí)間對IMBVP捕獲能力的影響。結(jié)果表明，隨著免疫磁珠與目標(biāo)菌孵育時(shí)間的延長，捕獲率明顯提高。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，捕捉率達(dá)到最高，為（88.22±2.68）%。時(shí)間延長至2.0 h，捕捉率基本穩(wěn)定。但當(dāng)孵育時(shí)間超過3.0 h時(shí)，捕捉率降低。根據(jù)原理，孵育時(shí)間過長會降低免疫磁珠的特異性，環(huán)境中的雜菌可能會與免疫磁珠相結(jié)合，導(dǎo)致捕捉率下降。因此，免疫磁珠與目標(biāo)菌的孵育時(shí)間應(yīng)在最佳時(shí)間范圍內(nèi)（圖3）。

2.2.2 孵育液pH確定。將副溶血弧菌菌懸液加入到免疫磁珠工作液中，分別用無菌1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0～8.0。結(jié)果表明，孵育環(huán)境對免疫磁珠的捕獲能力影響很大，酸性或堿性環(huán)境中捕獲率明顯下降。IMBVP與目標(biāo)菌孵育最佳pH為7.0～7.5（圖4）。

2.2.3 免疫磁珠工作體積的確定。在以上條件優(yōu)化過程中，免疫磁珠使用量均為0.5 mL。雖然捕捉效果較好，但是無法確定免疫磁珠最佳工作體積。為了避免浪費(fèi)，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)菌的捕捉情況確定最佳工作液體積。因此，該部分測試菌落數(shù)分為2個(gè)部分<30 cfu和30～300 cfu。結(jié)果表明，當(dāng)菌落數(shù)<30 cfu時(shí)，添加0.2 mL免疫磁珠得到的菌落數(shù)捕獲率高于90%。當(dāng)菌落數(shù)為30～300 cfu時(shí)，免疫磁珠添加量需要增大到0.4 mL（圖5）。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)人員在使用過程中可以根據(jù)菌懸液濃度來選擇免疫磁珠的添加量，為后續(xù)免疫磁珠捕獲性能評價(jià)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

2.3 免疫磁珠捕獲性能的評價(jià)

2.3.1 特異性。將最優(yōu)條件下制備的IMBVP分別加入到8種標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液的稀釋液中進(jìn)行捕獲試驗(yàn)。結(jié)果表明，IMBVP只捕獲副溶血性弧菌，其他菌落在弧菌顯色培養(yǎng)基中不生長（表1）。因此，自制副溶血弧菌免疫磁珠具有高特異性。

2.3.2 靈敏性。將最優(yōu)條件下制備的IMBVP加入到等濃度、不同體積的副溶血性弧菌菌懸液中，結(jié)果表明當(dāng)IMBVP加入到菌懸液中，分離能力會受到樣品體積的影響，特別是當(dāng)菌懸液濃度較低時(shí)，捕捉率會出現(xiàn)大幅度下降，相應(yīng)得到的相對誤差會增大。由表2可知，使用免疫磁珠法的準(zhǔn)確性要高于傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法。當(dāng)待測樣品體積為1 mL時(shí)，2種方法均適用。當(dāng)待測樣品體積為10 mL時(shí)，免疫磁珠富集目標(biāo)菌后檢測的準(zhǔn)確率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法。當(dāng)待測樣品體積為50 mL時(shí)，傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法的結(jié)果已嚴(yán)重偏離。根據(jù)結(jié)果可以得出，免疫磁珠富集檢測目標(biāo)菌靈敏度高，檢測限可達(dá)15 cfu/50 mL。

2.3.3 精密度。將制備好的IMBVP在最優(yōu)條件下富集副溶血弧菌，通過比較捕獲率的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)確定方法的精密度（表3）。結(jié)果表明，自制免疫磁珠對副溶血弧菌的檢測精密度高，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均在3%～6%。當(dāng)菌落數(shù)小于30 cfu/mL時(shí)，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均在標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，但相對于其他濃度的變異系數(shù)稍大。原因是由于菌落數(shù)過少時(shí)，基數(shù)過小，相對誤差增大，使得方差變化劇烈。

2.3.4 準(zhǔn)確性。將制備好的IMBVP在最優(yōu)條件下富集副溶血弧菌，通過考察多次檢測結(jié)果與真實(shí)值之間接近的程度來確定方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，當(dāng)副溶血弧菌菌懸液濃度在30～300 cfu/mL時(shí)，IMBVP檢測準(zhǔn)確度為（94.36±2.18）%；當(dāng)濃度<30 cfu/mL時(shí)，IMBVP檢測準(zhǔn)確度為（91.45±4.38）%。綜合來看，自制免疫磁珠對副溶血弧菌的檢測有較好的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與討論

免疫磁珠在制備過程中通常會受到磁珠類型[5-6]和制備條件[7-8]的影響。免疫磁珠的制備實(shí)質(zhì)上是磁珠表面的活性基團(tuán)與抗體外部基團(tuán)的結(jié)合過程[9]?；钚曰鶊F(tuán)包括羧基、氨基、巰基、甲苯磺酸基和環(huán)氧基等[10]。為了降低非特異性結(jié)合，研究人員又研制了Protein A/G磁珠。但是Protein A/G磁珠在使用過程中會出現(xiàn)免疫反應(yīng)，形成背景目標(biāo)蛋白[11]。鏈霉親和素磁珠也是目前常用磁珠之一[12]。但是鏈霉親和素磁珠在使用前要將抗體進(jìn)行生物素化。生物素化過程較為繁瑣，素化后要對素化效果進(jìn)行檢測，過程繁瑣，需要專業(yè)人員進(jìn)行操作。NHS磁珠是近年來新開發(fā)的基于NHS基團(tuán)磁珠，其磁核為納米四氧化三鐵，接有羧基磁珠殼層硅基，然后再連接羧基，最后NHS基團(tuán)修飾。NHS基團(tuán)與抗體可形成較為牢固的共價(jià)鍵連接，不易解離。這是該研究采用NHS磁珠作為基礎(chǔ)材料的重要原因。

制備條件是成功制備免疫磁珠的重要因素。免疫磁珠的制備條件主要受到磁珠粒徑大小[13]、溫度[14]、活化劑、時(shí)間[15]、pH[16]、抗體添加量等因素的影響。筆者所在課題組自2011年開始對免疫磁珠的制備進(jìn)行研究[17-20]，根據(jù)團(tuán)隊(duì)研究成果，參考磁珠類型及成品磁珠說明書建議，該研究主要以磁珠型號、時(shí)間和添加量作為免疫磁珠制備的優(yōu)化因素，經(jīng)試驗(yàn)確定制備方案，即采用0.1 mL HRCZ-03N400型NHS磁珠與0.2 mL抗血清進(jìn)行偶聯(lián)2 h可制備副溶血弧菌免疫磁珠。免疫磁珠對副溶血弧菌富集條件的優(yōu)化也是能夠獲得良好性能的重要保障。經(jīng)研究，確定了最佳孵育條件，在pH 7.0～7.4菌懸液中添加0.4 mL免疫磁珠孵育2 h。

通過對免疫磁珠制備條件的優(yōu)化和捕獲目標(biāo)菌株條件的優(yōu)化，可獲得高特異性免疫磁珠，其最低檢測限已達(dá)15 cfu/50 mL，與團(tuán)隊(duì)前期研究成果相比提高了8倍[17]，突破了傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法的局限，大大提高了檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。另外，該方法制備免疫磁珠的時(shí)間為4 h，與其他類型免疫磁珠制備方法相比，可減少23 h，大大提高效率。該制備方法成本較低，是國外產(chǎn)品價(jià)格的1/10。該研究自主制備的副溶血弧菌免疫磁珠已申請發(fā)明專利，并為免疫磁珠試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

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