驟冷對虎紋蛙和中華大蟾蜍不同組織中MDA含量和SOD活性的影響及比較

胡藝珂 李斌 王宇　邵晨

摘要 [目的]探討驟冷對虎紋蛙（Hoplobatrachus chinensis）和中華大蟾蜍（Bufo gargarizans）不同組織中

丙二醛（Malonaldehy，MDA）含量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的影響。[方法]采用低溫恒溫培養(yǎng)箱進行冷暴露試驗，研究了驟冷6 h分別對虎紋蛙和中華大蟾蜍肝臟、腸和腎臟MDA含量及SOD活性的影響，并比較驟冷6 h對虎紋蛙和中華大蟾蜍肝臟、腸和腎臟MDA含量及SOD活性的影響。[結(jié)果]驟冷刺激后虎紋蛙肝臟、腸和腎臟中MDA含量不變，SOD活性均降低。驟冷刺激后中華大蟾蜍肝臟中MDA含量不變，腸和腎臟中MDA含量增加；肝臟中SOD活性下降，腸組織中SOD活性增大，腎臟中SOD活性不變。對比驟冷對虎紋蛙和中華大蟾蜍肝臟、腸和腎臟中MDA含量和SOD活性的影響，發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍的肝臟、腸和腎臟中MDA的相對含量和SOD的相對活性均高于虎紋蛙的肝臟、腸和腎臟中MDA的相對含量和SOD的相對活性。[結(jié)論]在遇到驟冷刺激時虎紋蛙的氧化壓力和抗氧化能力均低于中華大蟾蜍。

關(guān)鍵詞 虎紋蛙；中華大蟾蜍；丙二醛；超氧化物歧化酶

中圖分類號 S917.4 文獻標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）14-0097-03

Effects of Shock Chilling on Malonaldehyhy Content and Superoxide Dismutase Activity in Different Tissues of Hoplobatrachus chinensis and Bufo gargarizans and Their Comparison

HU Yike1，LI Bin2，WANG Yu1，3 et al （1. School of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004；2.Lanxi Food and Drug Inspection and Testing Center，Lanxi，Zhejiang 321100； 3.Zhejiang Key Laboratory of Wild Animal Biotechnology and Conservation Utilization，Jinhua，Zhejiang 321004）

Abstract [Objective] To explore the effects of shock chilling on

malonaldehyhy （MDA）

content and

superoxide dismutase （SOD）

activity in different tissues of Hoplobatrachus chinensis and Bufo gargarizans.[Method] Cold exposure experiment was conducted by using low temperature incubators to study the effects of shock chilling 6 h on content of MDA and the activity of

SOD in the liver，intestine and kidney of H.chinensis and B.gargarizans.And the effects of shock chilling in 6 h on the MDA and the activity of SOD in the liver，intestine and kidney between H.chinensis and B.gargarizans were compared.[Result]After shock chilling，MDA content in the liver，intestine and kidney of H.chinensis had no change，and SOD activity decreased.After shock chilling，MDA content in the liver of B.gargarizans had no change，but that in the intestine and kidney increased； SOD activity in the liver decreased，SOD activity in the intestine increased，and SOD activity in the kidney of B.gargarizans remained unchanged.The effects of shock chilling on MDA content and SOD activity in the liver，intestine and kidney between H.chinensis and B.gargarizans were compared，it was found that the relative content of MDA and relative activity of SOD in the liver，intestine and kidney of B.gargarizans were higher than that in H.chinensis.[Conclusion] Under shock chilling，the oxidative stress and antioxidant capacity of H.chinensis were lower than those in B.gargarizans.

Key words Hoplobatrachus chinensis；Bufo gargarizans；MDA；SOD

虎紋蛙是我國二級保護動物，隸屬脊索動物門（Chordata）兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura）叉舌蛙科（Dicroglossidae）虎紋蛙屬（Hoplobatrachus）[1]，野生虎紋蛙由于受到人類過度捕捉[2]、氣候變化[3]、環(huán)境污染[4]、生境喪失[5-6]、物種入侵[7]和疾病感染[8]等因素的影響，虎紋蛙種群數(shù)量急劇下降。

中華大蟾蜍隸屬無尾目（Anura）蟾蜍科（Bufonidae）蟾蜍屬（Bufo），在我國廣泛分布于華東、華中、東北、華北、西北、西南省份，可生活在塘邊、河岸、溝沿、菜園、草叢或房屋周圍等多種環(huán)境中，以蚊子、孑孓、蝸牛、蛞蝓、蝗蟲、螻蛄、土蠶、蛾蝶和金龜子等多種生物為食[9]。筆者探討了驟冷對虎紋蛙和中華大蟾蜍的影響，分析了虎紋蛙種群數(shù)量下降的可能原因，旨在為野生虎紋蛙的保護和養(yǎng)殖虎紋蛙的溫度條件控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及其馴化

虎紋蛙和中華大蟾蜍均采自浙江省金華市某養(yǎng)殖場。將虎紋蛙和中華大蟾蜍分別置于水族箱（120 cm×40 cm×40 cm）內(nèi)馴化飼養(yǎng)，提供充足的水陸環(huán)境和遮蔽物，自然光照，馴化溫度為（24±1） ℃，飼養(yǎng)密度為15只/缸，每日以黃粉蟲（Tenebro molitor）活體投食1次，每日定時用經(jīng)曝氣脫氯自來水換水2次，清除死亡個體并記錄死亡率，馴化時間為7 d。

1.2 驟冷刺激試驗

選擇20只體表無傷、體質(zhì)量100 g左右的健康虎紋蛙，隨機平均分配到2個玻璃槽內(nèi)（30 cm×20 cm×15 cm，保持水深1 cm），然后將一個玻璃槽置入低溫恒溫培養(yǎng)箱（MIR-253，SANYO，Japan），箱內(nèi)溫度預(yù)降至（12.0±0.5）℃（處理組）；另一個玻璃槽置入低溫恒溫培養(yǎng)箱，箱內(nèi)溫度預(yù)設(shè)置為（24±0.5）℃（對照組）。分別在預(yù)設(shè)溫度下處理6 h后，每組取6只蛙用于MDA含量和SOD活性的測定。中華大蟾蜍處理方法同上。

1.3 樣品制備

將經(jīng)驟冷刺激試驗后的蛙從低溫恒溫箱內(nèi)取出，毀髓后迅速于冰上解剖，分別取肝臟、腸、腎臟，置于-20 ℃冰箱中待測，每批樣品在7 d內(nèi)完成測定。

1.4 MDA含量和SOD活性的測定

虎紋蛙和中華大蟾蜍的肝臟、腸和腎臟組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的測定方法參照試劑盒說明書（南京建成生物技術(shù)研究所）；虎紋蛙和中華大蟾蜍的肝臟、腸和腎臟組織中SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）法，參照Beauchamp等[10]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計與分析。相關(guān)數(shù)據(jù)進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗，均符合正態(tài)分布，進行獨立樣本t檢驗。試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 驟冷刺激對虎紋蛙MDA含量和SOD活性的影響

驟冷刺激后虎紋蛙肝臟（t=0.042，df=10，P>0.05）、腸（t=-0.172，df=10，P>0.05）和腎臟（t=-0.767，df=10，P>0.05）MDA含量與對照組無明顯差異（圖1）；肝臟（t=-26.18，df=10，P<0.01）、腸（t=-5.171，df=10，P<0.01）和腎臟（t=-3.394，df=10，P<0.01）組織中SOD的活性較對照組極顯著降低（圖2）。這表明虎紋蛙采用減少耗氧量，降低有氧呼吸強度，抵御驟冷刺激。

2.2 驟冷刺激對中華大蟾蜍MDA含量和SOD活性的影響

驟冷刺激后中華大蟾蜍肝臟組織脂質(zhì)過氧化物MDA含量與對照組無明顯差異（t=2.084，df=5.793，P>0.05），而腸（t=13.868，df=10，P<0.01）和腎臟（t=14.095，df=10，P<0.01）組織中MDA含量較對照組極顯著增加（圖3）；肝臟

組織中SOD的活性較對照組均極顯著降低（t=-6.235，df=10，P<0.01），而腸組織中SOD活性較對照組極顯著增加（t=10.972，df=6.606，P<0.01），腎臟組織中SOD活性基本不變（t=-1.904，df=10，P>0.05）（圖4）。這表明中華大蟾蜍主要采用增加耗氧量，增加有氧呼吸強度抵御驟冷刺激。

2.3 比較驟冷對虎紋蛙和華大蟾蜍肝臟、腸和腎臟中MDA含量和SOD活性的影響

將對照組24 ℃、6 h和處理組12 ℃、6 h處理后同一組織中的MDA含量求百分比后，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，中華大蟾蜍的肝臟、腸和腎臟中MDA的相對含量均高于虎紋蛙。同樣，將對照組和處理組6 h處理后同一組織中的SOD活性求百分比，結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，中華大蟾蜍的肝臟、腸和腎臟中SOD的相對活性均高于虎紋蛙。

3 討論與結(jié)論

肝臟、腸和腎臟是兩棲類重要的內(nèi)臟器官，在糖原的合成與分解、脂質(zhì)的吸收與利用以及機體的排毒與解毒等方面有著重要的作用。MDA是膜脂在機體中過氧化最重要的產(chǎn)物之一，是體現(xiàn)生物體抗氧化能力的常用指標(biāo)，其含量反映 生物體受氧化損傷程度[11]。SOD是一種生物酶，催化氧自

由基發(fā)生歧化反應(yīng)，減少氧自由基對機體的傷害，能清除機

體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)[12]。MDA含量高低間接反映生物體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，而SOD活性又間接反映生物體清除氧自由基的能力。

同時測量MDA含量和SOD活性，可分析生物體內(nèi)氧化壓力和抗氧化能力的大小。

該研究結(jié)果表明，驟冷刺激后虎紋蛙肝臟、腸和腎臟中MDA含量不變，而其SOD活性均降低，說明虎紋蛙在遇到驟冷環(huán)境時降低呼吸強度，減少體內(nèi)能量消耗來抵御低溫環(huán)境。在驟冷刺激對中華大蟾蜍MDA含量和SOD活性的影響試驗中，驟冷刺激后中華大蟾蜍肝臟中MDA含量不變，腸和腎臟中MDA含量增加，說明腸和腎臟增加代謝強度應(yīng)對驟冷刺激。肝臟中SOD活性下降，腸組織中SOD活性增大，腎臟中SOD活性不變，說明肝臟組織中氧自由基含量下降，表明肝臟組織中代謝速率減小。腸組織中的氧自由基含量增加，表明腸組織中代謝速率增加。綜合比較驟冷對虎紋蛙和中華大蟾蜍肝臟、腸和腎臟中MDA含量和SOD活性影響，發(fā)現(xiàn)中華大蟾蜍的肝臟、腸和腎臟中MDA的相對含量和SOD的相對活性均高于虎紋蛙的肝臟、腸和腎臟中MDA的相對含量和SOD的相對活性。這說明在遇到驟冷刺激時，虎紋蛙的氧化壓力和抗氧化能力均低于中華大蟾蜍，這可能是野生虎紋蛙野外種群數(shù)量減少的原因之一。

參考文獻

[1]

田永斌，夏明明，邵晨.中國虎紋蛙種質(zhì)資源研究進展[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，34（4）：464-468.

[2] 符史杭.虎紋蛙在海南的瀕危狀況及其保護措施[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[3] 徐劍，鄒佩貞，溫彩燕，等.廣東北部亞熱帶雨林兩棲動物物種多樣性及其保護[J].動物學(xué)雜志，2001，36（4）：30-33.

[4] 李斌，黃艷，邵晨，等.銅離子急性脅迫對虎紋蛙肝臟中三羧酸循環(huán)及自由基代謝的影響[J].水生生物學(xué)報，2015，39（6）：1160-1168.

[5] CUSHMAN S A.Effects of habitat loss and fragmentation on amphibians：A review and prospectus[J].Biological conservation，2006，128（2）：231-240.

[6] 李世森，王宇，邵晨，等.虎紋蛙（Hoplobatrachus chinensis）繁殖后期的生境特征及生境選擇[J].生態(tài)學(xué)雜志，2014，33（11）：3018-3025.

[7] FISHER R N，SHAFFER H B.The decline of amphibians in Californias Great Central Valley[J].Conservation biology，1996，10（5）：1387-1397.

[8] KELLEY J，WALTER L，TROWSDALE J.Comparative genomics of major histocompatibility complexes[J].Immunogenetics，2005，56（10）：683-695.

[9] 王超.銅對中華大蟾蜍蝌蚪生長發(fā)育與抗氧化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響[D].西安：陜西師范大學(xué)，2016.

[10] BEAUCHAMP C，F(xiàn)RIDOVICH I.Superoxide dismutase：Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Analytical biochemistry，1971，44（1）：276-287.

[11] MITTLER R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J].Trends in plant science，2002，7（9）：405-410.

[12] 王妤，莊平，章龍珍，等.鹽度對點籃子魚的存活、生長及抗氧化防御系統(tǒng)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報，2011，35（1）：66-73.