響應(yīng)面法優(yōu)化仙人掌酵素的發(fā)酵工藝

張良 劉媛潔 包珍 肖勇生

摘要 [目的]利用酵母菌和乳桿菌發(fā)酵仙人掌制備仙人掌酵素。[方法]首先以糖的添加量、菌種比例、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定超氧化物歧化酶（SOD）活性較大時(shí)各因素相應(yīng)的范圍；然后分析試驗(yàn)條件，應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，以糖的添加量、接種量和發(fā)酵溫度為因素，以SOD活力的變化為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，得出重要因素的最佳水平，從而確定最佳的發(fā)酵條件。[結(jié)果]經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化獲得仙人掌酵素發(fā)酵工藝的參數(shù)如下：糖的添加量55.0%、接種量4.0%、發(fā)酵溫度34.0 ℃，在優(yōu)化條件下，SOD活力達(dá)到323.21 U/g。 [結(jié)論]該研究可為仙人掌酵素的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 仙人掌；酵素；發(fā)酵；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào) TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0170-03

Abstract [Objective]To prepare cactus enzyme by fermentation of cactus with yeast and lactobacillus. [Method]The influence of additive amount of sugar，proportion of species，inoculation amount，fermentation temperature and fermentation time on SOD enzyme activity producing by cactus fermentation were studied through single factor experiment，and approximately determined the amount of the various factors.Then the additive amount of sugar，the inoculation amount and the fermentation temperature were chosed as three factors，the center combination of BoxBehnken design experiments was used to study the change of SOD enzyme activity in the fermentation as response value.The experiment data were analyzed by the SAS statistical software to set up quadratic response surface regression model for obtaining the optimal level of the important factor， determining the optimum conditions of fermentation. [Result]The response surface method results showed the optimum condition of producing SOD enzyme activity by cactus fermentation was as follow： the additive amount of sugar 55.0%，the inoculation amount 4.0% and the fermentation temperature 34.0 ℃，in the optima conditions，the SOD enzyme activity was 323.21 U/g. [Conclusion]The study can provide scientific basis for the production of cactus enzyme.

Key words Cactus；Enzyme；Fermentation；Response surface methodology

仙人掌（Opuntia spp.）為仙人掌科（Cactaceae）仙人掌屬（Opuntia）雙子葉植物，含有豐富的微量元素、蛋白質(zhì)、維生素、多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、果膠及18種氨基酸[1-2]。仙人掌具有降血糖、降血脂、降血壓及預(yù)防心腦血管疾病等功效[3-4]。酵素（enzyme）又稱(chēng)作酶，是生物體產(chǎn)生的一種具有催化作用的大分子物質(zhì)[5]。它是以一種或多種果蔬等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵制備而成的，富含多種生物酶、礦物質(zhì)、維生素、有機(jī)酸、多酚類(lèi)等功能性生物發(fā)酵產(chǎn)品[6]，具有抗氧化、抗菌消炎、潤(rùn)腸通便、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善消化吸收等保健功能[7-8]。筆者以仙人掌為原料，利用酵母菌和乳桿菌發(fā)酵制備仙人掌酵素，探索制備的工藝條件，為仙人掌的綜合利用及工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。仙人掌，市售米邦塔仙人掌；酵母菌，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌，江西省食品發(fā)酵研究所微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器。P270普通搖床，中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠(chǎng)；移液槍?zhuān)虾s泰生物工程有限公司；Sw-CJ-1Bu型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠(chǎng)；全自動(dòng)滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器材廠(chǎng)；3K18冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；恒溫水浴鍋，江蘇金壇市瑞華儀器有限公司；pH計(jì)（S23C）型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠(chǎng)；分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 工藝流程

仙人掌→清洗→臭氧處理→淋干→切塊→糖和原料按比例混合→裝罐→添加復(fù)合菌種→密封恒溫發(fā)酵90 d→后熟處理→過(guò)濾→仙人掌酵素原液。

1.3 操作要點(diǎn)

1.3.1 預(yù)處理。清洗仙人掌的表面固型雜質(zhì)，去除仙人掌上的毛刺，用臭氧發(fā)生器處理后瀝干，將仙人掌切成4 cm3的小塊備用。

1.3.2 酵母菌的活化和培養(yǎng)。將酵母菌菌粉用蒸餾水混勻，30 ℃水浴活化1 h后，無(wú)菌條件下取適量菌液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。繼續(xù)重復(fù)上述步驟，繼代培養(yǎng)2次后，菌種才可用于發(fā)酵使用。

1.3.3 乳桿菌的活化和培養(yǎng)。將乳桿菌菌粉用蒸餾水混勻，37 ℃水浴活化1 h后，無(wú)菌條件下取適量菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。繼續(xù)重復(fù)上述步驟，繼代培養(yǎng)2次后，菌種才可用于發(fā)酵使用。

1.3.4 接種和發(fā)酵。將處理好的仙人掌塊按照一層紅糖一層仙人掌塊的方式逐層放入到發(fā)酵罐中，糖的添加量為50%，調(diào)節(jié)初始pH為6.5，將酵母菌和乳桿菌以2∶3的體積比進(jìn)行混合后制備成混合菌種（酵母菌活菌數(shù)為1×106 CFU/mL，乳桿菌活菌數(shù)為1×107 CFU/mL），并按照4%的接種量加入到發(fā)酵罐中，在34 ℃恒溫密閉發(fā)酵90 d，當(dāng)發(fā)酵液不再產(chǎn)生氣泡時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

1.3.5 后熟與過(guò)濾。發(fā)酵罐在5 ℃條件下恒溫密閉保藏30 d，使發(fā)酵液中各成分充分反應(yīng)。后熟后將發(fā)酵液在150 r/min離心10 min的條件下過(guò)濾分離，所得液體為仙人掌酵素原液。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)。分別以糖的添加量、菌種比例、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為響應(yīng)因素，研究不同水平下各因素對(duì)仙人掌酵素超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響。

1.4.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，以糖的添加量、接種量、發(fā)酵溫度為自變量，以SOD活力為響應(yīng)值繪制響應(yīng)面曲線(xiàn)，確定最佳試驗(yàn)條件。Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.5 分析方法

SOD活力測(cè)定：采用鄰苯三酚自氧化法對(duì)試驗(yàn)中SOD的活性進(jìn)行測(cè)定[9-10]。SOD酶活定義：在1 mL反應(yīng)液中，1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定為1個(gè)活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 糖的添加量對(duì)SOD活性的影響。

由圖1可知，SOD活力隨著糖添加量的增加而升高，當(dāng)糖的添加量超過(guò)50%時(shí)，酶活力開(kāi)始下降。同時(shí)，可以看出糖的添加量在40%～60%范圍內(nèi)對(duì)酶活力的影響顯著，因此選擇此范圍內(nèi)的接種量作為Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的影響因子。

2.1.2 菌種比例對(duì)SOD活性的影響。

由圖2可知，在酵母菌逐漸增加、乳桿菌逐漸減少的配比下，酶活力隨酵母菌比例的升高而增大，當(dāng)酵母菌和乳桿菌的比例為2∶3時(shí)，SOD活力達(dá)到最大，酵母菌比例繼續(xù)增加時(shí)，酶活力反而有緩慢下降的趨勢(shì)。從菌種比例對(duì)SOD活力的影響來(lái)看，當(dāng)酵母菌的菌種增加到2∶3之后時(shí)，其酶活力變化不大，所以不選擇此因子進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，同時(shí)確定最佳的菌種比例（酶母菌∶乳桿菌）為2∶3。

2.1.3 接種量對(duì)SOD活性的影響。

由圖3可知，發(fā)酵液中SOD活力隨著菌種接種量的增加而增加，當(dāng)接種量為4%時(shí)SOD活力達(dá)到最高值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榻臃N量過(guò)大，發(fā)酵產(chǎn)物顯著減少，因此，選定接種量在3%～5%的范圍進(jìn)行下一步Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)SOD活性的影響。

由圖4可知，SOD活力隨著培養(yǎng)溫度的升高而增大，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)34 ℃時(shí)，酶活力開(kāi)始下降。同時(shí)，可以看出培養(yǎng)溫度在32～36 ℃范圍內(nèi)對(duì)酶活力的影響較顯著，因此選擇此范圍的發(fā)酵溫度作為Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的影響因子。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD活性的影響。

由圖5可知，SOD活力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低。在發(fā)酵初期SOD活性較小，發(fā)酵60 d后酶活開(kāi)始逐漸上升；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為90 d時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。然而，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)90 d后，酶活力卻有下降趨勢(shì)。原因可能是發(fā)酵后期菌體處于衰亡期導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，但又未及時(shí)補(bǔ)充，抑制了SOD的不斷積累。所以，選擇發(fā)酵時(shí)間為90 d。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

按照“1.4.2”方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。采用Design Expert 7.0軟件，對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程，方差分析結(jié)果如下：

由方差分析可知，該試驗(yàn)所建立的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性（P模型<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），校正決定系數(shù)R2Adj為0.966 0，表明有約96.60% 的SOD活力由此模型進(jìn)行解釋?zhuān)环匠痰臎Q定系數(shù)R2為0.985 1，表明仙人掌酵素發(fā)酵中SOD活力變化建立的方程對(duì)試驗(yàn)的擬合優(yōu)度較好。各自變量試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響如下：因素 A（糖的添加量）和C（發(fā)酵溫度）對(duì)SOD活力的影響均極顯著（P<0.01），因素B（接種量）對(duì)SOD活力的影響顯著（P<0.05）。

二次項(xiàng)因素A2、B2和C2均極顯著（P<0.01），具有顯著的曲線(xiàn)關(guān)系。BC（接種量與發(fā)酵溫度）對(duì)SOD活力有極顯著（P<0.01）的交互影響。模型的F值可以反映各因素對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值的影響越大，重要性越大[11]。 可見(jiàn)，各因素對(duì)SOD活力的影響程度大小順序?yàn)樘堑奶砑恿?發(fā)酵溫度>接種量。

為直觀(guān)表現(xiàn)2個(gè)因素對(duì)SOD活力的影響，可固定一個(gè)因素的值，分析另外2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。圖6可反映各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線(xiàn)的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示2個(gè)因素交互作用顯著，而圓形則與之相反?？梢?jiàn)，糖的添加量和接種量及糖的添加量和發(fā)酵溫度的交互作用不顯著，接種量和發(fā)酵溫度的交互作用極顯著。同時(shí)，3個(gè)響應(yīng)面均為凸型曲面，表明SOD活力存在極高值。根據(jù)對(duì)SOD活力的二次多項(xiàng)方程求解，得到最佳的仙人掌酵素發(fā)酵工藝條件：糖的添加量 55.3%、接種量4.1%、發(fā)酵溫度34.42 ℃，在此最佳條件下，SOD活力理論上可達(dá)324.14 U/g。

考慮試驗(yàn)可操作性，修正最佳工藝條件為糖的添加量 55.0%、接種量4.0%、發(fā)酵溫度34.0 ℃，在此條件下，連續(xù)進(jìn)行3組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得SOD活力的平均值為 323.21 U/g，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為 0.3%，說(shuō)明模型擬合性良好，驗(yàn)證了模型的有效性。該二元多項(xiàng)回歸方程為仙人掌酵素發(fā)酵工藝提供了一個(gè)合適的模型。

3 結(jié)論

筆者在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，對(duì)仙人掌酵素發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得的最佳配方為糖的添加量 55.0%、接種量4.0%、發(fā)酵溫度34.0 ℃，在此最佳條件下，SOD活力可達(dá) 323.21 U/g。該仙人掌酵素的發(fā)酵工藝在工業(yè)化生產(chǎn)中具有一定的指導(dǎo)意義。

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