山東省蒼山大蒜Alliumsativum貯藏期新病原菌的分離與鑒定

鐘文文 劉婷婷 趙志龍

摘要 對(duì)臨沂市蘭陵縣蒼山大蒜貯藏期病害情況進(jìn)行了調(diào)查，采用柯赫氏法則和病斑顯微觀察法對(duì)病原菌株lyu20170012進(jìn)行了驗(yàn)證，并通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和rDNA ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，從病斑上分離得到4種真菌和1種細(xì)菌，經(jīng)致病性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌株lyu20170012具有致病性，將lyu20170012菌株鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

關(guān)鍵詞 尖孢鐮刀菌；大蒜鱗莖病害；柯赫氏法則；病原菌

中圖分類(lèi)號(hào) S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0140-05

Abstract The investigation on Cangshan garlic storage diseases in Lanling County of Linyi City was carried out. The pathogenity of pathogenic strain lyu20170012 was detected and verified by the Koch and the microscopic observation. Results showed as followed： four kinds of fungi and one kind of bacteria were isolated from the Cangshan garlic lesion；the lyu20170012 strain was identified as Fusarium oxysporum by morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis.

Key words Fusarium oxysporum；Garlic diseases；Koch；Pathogenic fungi

大蒜（Allium sativum），是著名的兼有藥效的蔬菜，屬百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，具止痢、止咳、健胃、殺菌、驅(qū)蟲(chóng)之功效，南、北各省均有栽植，原產(chǎn)中亞，栽培歷史悠久[1]。蒼山大蒜也稱(chēng)作“蘭陵大蒜”，亦稱(chēng)“葫”或“葫蒜”，產(chǎn)于“中國(guó)蒜鄉(xiāng)”山東省臨沂市蘭陵縣。蒼山大蒜歷史悠久，是在蘭陵縣特定的生態(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人為定向培育而形成的蘭陵特有品種，為山東省傳統(tǒng)名特蔬菜之一，是中國(guó)出口的優(yōu)質(zhì)大蒜。

蒼山大蒜隨著種植面積的逐年擴(kuò)大，大蒜有害生物亦呈快速增加趨勢(shì)，危害越來(lái)越大。在大蒜生長(zhǎng)期間和倉(cāng)儲(chǔ)期間，有害生物的危害造成蒜薹、蒜頭減產(chǎn)和霉?fàn)€[2]。蒜頭（大蒜鱗莖）在貯藏調(diào)運(yùn)期間可發(fā)生多種病害，引起蒜頭腐爛和污損，嚴(yán)重降低其商品價(jià)值和種用價(jià)值。大蒜鱗莖（蒜頭）是重要的市場(chǎng)和產(chǎn)地檢疫農(nóng)產(chǎn)品，蒜頭病害還是出境植物檢疫的重要對(duì)象，鱗莖腐爛是引起大蒜減產(chǎn)的主要因素[3]。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)大蒜貯藏期鱗莖病害的研究有著重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于大蒜病害的研究報(bào)道。Matuo等[4]報(bào)道尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）可以導(dǎo)致大蒜鱗莖基腐病。Kwon[5]研究報(bào)道，齒梗孢屬真菌（Sclerotium rolfsii）可以引起大蒜莖腐爛病。Lee等[6]研究報(bào)道，埃里格孢（Embellisia allii）可引起大蒜鱗莖潰瘍病和黑斑病，而且常常與病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.cepae）混合互作、共同為害。群體效應(yīng)是近來(lái)日益受到廣泛關(guān)注的一種細(xì)菌群體行為調(diào)控機(jī)制，是一種信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞的通訊系統(tǒng)。QQ效應(yīng)化合物和酶可在胡蘿卜、大豆、豌豆苗、辣椒、大蒜等植物中天然存在[7]。Pontin等[8]研究表明，大蒜感染白腐病Sclerotium cepivorum病原后，可產(chǎn)生萜烯類(lèi)抗真菌物質(zhì)。Chand等[9]研究表明，miRNA394可調(diào)控大蒜病原菌[F.oxysporum f.sp.cepae（FOC）]的感染機(jī)制。Gálvez等[10]報(bào)道引起西班牙貯藏期大蒜鱗莖腐爛病的病原是層生鐮刀菌（F.proliferatum），它是一種世界性廣泛分布種，還可為害其他一些作物。葛蕓英等[3]報(bào)道了尖孢鐮刀菌是引起江蘇太倉(cāng)及南京周邊大蒜鱗莖腐爛病的病原之一。張軍高等[11]報(bào)道了甘肅省大蒜干腐病病原菌是尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和茄病鐮刀菌。商鴻生等[12]對(duì)大蒜鱗莖病害進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，包括灰霉病、曲霉病、青霉病、紅腐病、炭疽病、白腐病（黑腐小核菌?。⒓t粉病、黑斑病、軟腐病、病毒病害11種病害。盛紅梅等[13]報(bào)道甘肅省大蒜主要產(chǎn)區(qū)的病害調(diào)查和病原鑒定，共發(fā)現(xiàn)大蒜病害14種，其中真菌性病害9種，細(xì)菌性病害1種，主要包括白腐病、白斑病、紫斑病、花葉病、黑頭病、葉霉病、青霉病、煤斑病、銹病、軟腐病等[14]。有關(guān)蒼山大蒜鱗莖病害的致病菌鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者對(duì)山東省蒼山大蒜鱗莖病原菌進(jìn)行了調(diào)查與研究，旨在為大蒜的防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

2016年1月至2017年11月對(duì)臨沂市蘭陵縣大蒜貯藏期病害情況進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)蒼山大蒜在貯藏期間發(fā)生較為嚴(yán)重的病害，對(duì)感病情況、病原種類(lèi)及發(fā)生癥狀進(jìn)行了觀察、記錄和拍照。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化。

采用常規(guī)的組織分離方法，將病原菌置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7～14 d。在體視鏡下挑取適量孢子和菌絲，制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察，待菌絲和孢子形態(tài)特征完全一致時(shí)，即可利用單孢分離法再次轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到的菌株為純菌株。

1.2.2

致病性測(cè)定。

分別以病原菌的菌絲塊作為接種體對(duì)其在蒜瓣上的致病性進(jìn)行測(cè)定。選擇健康的蒜瓣進(jìn)行接種，蒜瓣先用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，再分有傷口（用無(wú)菌毛筆在葉片表面刷3次）接種和無(wú)傷口接種，以有傷口不接種和無(wú)傷口不接種為對(duì)照，接種后保濕24 h，每隔1～2 d觀察癥狀。發(fā)病后，從病斑再次分離病原菌，并與原接種菌進(jìn)行比較。

1.2.3 病原菌的確認(rèn)。

1.2.3.1 柯赫氏法則驗(yàn)證。

將純化后的菌株重新接種到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接種菌絲塊觀察有刺傷的和無(wú)刺傷的蒜瓣發(fā)病癥狀與田間觀察到的是否相同，并設(shè)置不接種作為對(duì)照。用發(fā)病的病斑進(jìn)行常規(guī)分離，證明發(fā)病菌是否為大蒜病原菌。

1.2.3.2

蒜瓣組織解剖觀察驗(yàn)證。

選取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水沖洗干凈，然后再用無(wú)菌水洗1～3次，保證蒜瓣表面未附著其他微生物和塵土顆粒。利用徒手切法，切取病斑及其周?chē)慕M織，選取合適材料制成玻片，進(jìn)行病原菌的顯微觀察和驗(yàn)證。

1.2.4 病原菌形態(tài)學(xué)的特征觀察。

1.2.4.1 病原菌的培養(yǎng)性狀觀察。將病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7～8 d，記錄菌落形態(tài)和顏色，觀察分生孢子的形狀和大小等形態(tài)學(xué)特征。

1.2.4.2

病原菌的顯微特征觀察。在培養(yǎng)后的樣品菌落上，挑取菌絲和孢子，制片觀察其顯微特征，同時(shí)參照有關(guān)資料進(jìn)行菌種的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.5 病原菌rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列分析。

1.2.5.1

病原菌總DNA的提取。選擇試驗(yàn)菌株，采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d，離心收集菌絲體，經(jīng)冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱保存。利用OMEGA公司試劑盒提取DNA。

1.2.5.2

rDNA-ITS的擴(kuò)增與序列測(cè)定。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增該病原菌的ITS和5.8S rDNA。PCR反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系，包括2 μL（約10 ng）模板DNA溶液、5.0 μL 10×PCR buffer、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、7.5 pmol/μL ITS1和ITS4引物各1.5 μL、0.5 μL 5 U/μL Taq酶（含MgCl2），加ddH2O至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以后，直接委托山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)序中心進(jìn)行純化和序列測(cè)定。

1.2.5.3

病原菌rDNA ITS序列同源性比較。將供試菌株的rDNA ITS序列在NCBI網(wǎng)站上用Blast軟件與GenBank中已知種屬的rDNA進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，再結(jié)合DNAMAN和mega 6.0軟件進(jìn)行同源性比較分析，從而對(duì)供試菌株進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜瓣的危害與癥狀特點(diǎn)

對(duì)蒼山縣采收的新鮮大蒜、市售大蒜和倉(cāng)儲(chǔ)大蒜進(jìn)行了抽樣調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒜頭病害種類(lèi)復(fù)雜，其發(fā)生規(guī)律不盡相同。初侵染菌源有的來(lái)自田間，有的來(lái)自貯藏處所。有些病害在田間已經(jīng)發(fā)生，在貯運(yùn)期間進(jìn)一步發(fā)展。有些病原菌在田間侵害蒜株部，造成根部腐爛，在貯運(yùn)期間由根部蔓延到蒜頭基部，蒜瓣變黃褐色，干枯。調(diào)查表明，蒜頭內(nèi)在質(zhì)量較差、生活力降低或收獲貯運(yùn)期間受到機(jī)械損傷，是貯運(yùn)病害發(fā)生的主要內(nèi)在因素。大部分貯蒜病害的病原菌腐生性較強(qiáng)，分布很廣，蒜頭不論在田間還是在貯運(yùn)過(guò)程中都要被病原菌污染。貯藏期間通風(fēng)不暢，蒜頭受潮發(fā)熱，則是主要的外部條件。做好田間病害防治，保持貯運(yùn)環(huán)境衛(wèi)生，盡量減少菌原很重要。貯運(yùn)條件對(duì)蒜頭病害的發(fā)生起著關(guān)鍵作用。在隨機(jī)抽樣調(diào)查的蒜頭中，蒜瓣感病率達(dá)6%～10%，表明大蒜倉(cāng)儲(chǔ)期病害發(fā)生較嚴(yán)重，嚴(yán)重影響大蒜的質(zhì)量和蒜農(nóng)的收益。

大蒜鱗莖受害后，感病蒜瓣，病斑顏色呈褐色、黑色或青色，凹陷，變硬或者變軟、收縮或者濕潤(rùn)狀，有時(shí)可見(jiàn)表面長(zhǎng)出黑色粉狀物、青色粉狀物或者白色絨毛，有時(shí)呈半透明淡褐色等?？傊?，大蒜鱗莖受害后的癥狀因病原物的不同而各有不同。

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的分離和純化。

從蘭陵縣蒼山大蒜基地采集樣品500份，從中選取代表性感病蒜瓣，于PDA培養(yǎng)基平板上分離病原菌，25 ℃下培養(yǎng)，各標(biāo)樣均長(zhǎng)出不同的菌落，通過(guò)菌落特征和顯微特征觀察，參照有關(guān)資料，將大蒜蒜瓣病斑分離物初步鑒定為以下5種：A曲霉（Aspergilus sp.），B青霉（Penicillium sp.），C枯草芽孢桿菌（Bacillus sp.），D、E鐮刀菌（Fusarium sp.）。以上分離物的屬種歸屬和致病性需要進(jìn)一步驗(yàn)證，其菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。該研究只對(duì)致病較強(qiáng)的鐮刀菌進(jìn)行了深入研究，其他分分離物的致病性尚未研究。

2.2.2 病原菌的確認(rèn)。

采用柯赫氏法則驗(yàn)證，將分離得到的菌株重新接種到健康的大蒜蒜瓣上，回接7～9 d，接種菌絲塊的大蒜蒜瓣全部發(fā)病，有刺傷的葉片發(fā)病比無(wú)刺傷的葉片早1～2 d，癥狀與田間觀察

到的相同，對(duì)照不發(fā)??；用發(fā)病的病斑進(jìn)行常規(guī)分離，再次獲得與原分離菌基本一致的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為大蒜蒜瓣的病原菌。經(jīng)驗(yàn)證5種分離物中，致病性為尖孢鐮刀菌>枯草芽孢桿菌>變紅鐮刀菌>曲霉>青霉。該研究只對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行了測(cè)序和鑒定等。大蒜病原菌尖孢鐮刀菌驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2.3 病原菌的形態(tài)特征。

2.2.3.1

分離物的培養(yǎng)性狀觀察。將大蒜蒜瓣的病斑分離物培養(yǎng)后，其菌落形態(tài)特征見(jiàn)圖3。在PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，直徑達(dá)9 mm，菌落平展，絨毛狀，灰白色，背觀淡褐色。培養(yǎng)14 d后菌落為粉色。

2.2.3.2 顯微特征觀察及形態(tài)學(xué)鑒定。

（1）自然基質(zhì)上的顯微特征觀察。選取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水沖洗干凈，再用70%乙醇浸泡1～3 min，無(wú)菌水洗1～3次，保證葉片表面未附著其他微生物和塵土顆粒。利用徒手切法，采用縱向和橫向的方法切取病斑及其周?chē)娜~片組織，選取合適材料制成玻片，用于病原菌的顯微觀察和驗(yàn)證。由圖4可知，大蒜蒜瓣內(nèi)部未見(jiàn)病原菌的菌絲分布等，只能觀察到大蒜變褐部分有病原孢和菌絲孢子的存在，孢子和菌絲在蒜瓣表面分布多聚集在傷口周?chē)?，其他部分偶有零星分布；菌絲淡褐色，有分枝，偶見(jiàn)膨大厚垣細(xì)胞和褐色細(xì)胞的集合體，菌絲體整體與分離培養(yǎng)物的狀態(tài)較為一致，菌絲寬度2～10 μm，膨大端部細(xì)胞寬度達(dá)18 μm。病斑上發(fā)現(xiàn)的其他真菌在病原深層組織中分布較少，表明其他真菌可能是空氣中的污染菌。

（2）PDA培養(yǎng)基上的顯微特征。在25 ℃PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，形成圓形菌落。菌落平展，生長(zhǎng)速度快，菌落灰白色，菌絲部分埋生，部分表生。背面淡褐色。菌絲淡色，有分枝，表面光滑，有隔膜，菌絲寬度3～13 μm（圖5-B）。產(chǎn)孢梗多對(duì)生，偶見(jiàn)輪生和其他著生方式，柱狀或者倒棒狀，有時(shí)為產(chǎn)包瓶體直接側(cè)生于菌絲上或者端生。分生孢子卵形、梭形，大小不等，（3～12）μm×（1～3）μm，極少見(jiàn)彎曲鐮刀型孢子，表面光滑，淡褐色，無(wú)隔膜，兩端尖細(xì)，產(chǎn)孢量較大（圖5-A和圖5-C）。

2.2.4 病原菌rDNA-ITS的序列分析及同源性。

因?yàn)檎婢螒B(tài)學(xué)特征受培養(yǎng)基和基質(zhì)的影響較大，所以單純進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類(lèi)還缺乏一定的科學(xué)性。為保證病原菌鑒定的準(zhǔn)確性，該研究對(duì)分離得到的幾種病原物進(jìn)行了分子生物學(xué)輔助鑒定。對(duì)1～5號(hào)菌分別進(jìn)行了rDNA-ITS序列分析，對(duì)7號(hào)細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA序列測(cè)定。其中，5號(hào)菌株lyu20170012的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖6），得到1個(gè)約507 bp的片段基因序列。

將菌株lyu20170012的rDNA ITS基因序列與GenBank中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，與其同源性100%的菌株種類(lèi)均為Fusarium oxysporum，這些同源性菌株登錄號(hào)為MF435932.1、MF435931.1、KY090780.1、KY090783.1、KX343149.1、KX343146.1、MF355380.1、MF355379.1、MF305836.1、LT841236.1、LT841222.1、MF136593.1、KX276606.1。再結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，最終將該病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)蒼山大蒜貯藏期鱗莖感病情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)蒜瓣感病率在10%以上。對(duì)病斑菌群進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了5種微生物，其中1種為枯草芽孢桿菌，其他為真菌，它們分別為青霉、曲霉、根霉、變紅鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、匐柄霉。根據(jù)致病性測(cè)定，發(fā)病最嚴(yán)重的是尖孢鐮刀菌，其次為解淀粉芽孢桿菌，其他依次為變紅鐮刀菌、黑曲霉、青霉和匐柄霉。該研究只對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)技術(shù)，最后確定病原為尖孢鐮刀菌，該菌在蒼山大蒜上首次發(fā)現(xiàn)。其他真菌的致病性正在陸續(xù)研究之中。由此看出，倉(cāng)儲(chǔ)期大蒜蒜瓣病害的病原菌不是單一的，有時(shí)是混合菌群，而且每個(gè)蒜瓣的病原菌群可能有所差別。

大蒜真菌類(lèi)疾病，主要為害近地面假莖基部或貯存的鱗莖，嚴(yán)重時(shí)影響大蒜的產(chǎn)量和質(zhì)量。大蒜病害主要有大蒜葉枯病、大蒜莖腐病、大蒜紫斑病、大蒜細(xì)菌性軟腐病、大蒜灰霉病、大蒜銹病及大蒜病毒病等[7]。該研究首次報(bào)道蒼山大蒜鱗莖病原物為尖孢鐮刀菌。

大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，是各國(guó)人民喜愛(ài)的香辛類(lèi)蔬菜，在世界各地普遍種植。大蒜不僅是人們常用的安全無(wú)毒、無(wú)公害、無(wú)殘留的調(diào)味品，而且是成本低、無(wú)毒、無(wú)副作用、具有獨(dú)特的藥理和營(yíng)養(yǎng)保健功能。大蒜由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值而成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)[15]。摸清蒼山大蒜倉(cāng)儲(chǔ)期病害種類(lèi)，開(kāi)發(fā)研制防控貯藏期大蒜病害新技術(shù)具有廣闊的前景。

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