黑棘鯛群體線粒體16SrRNA基因序列比較

王澤園 毛欣琪 上官靜波

摘要 [目的]比較黑棘鯛群體線粒體16S rRNA基因序列。[方法]運用黑棘鯛線粒體16SrRNA基因片段，對來自我國沿海的10個野生黑棘鯛群體進行了遺傳多樣性以及遺傳分化的分析。[結果]10個群體的80個個體中，堿基A、C、G、T的平均含量分別為31.6%、24.2%、22.7%、21.5%，一共定義了9種單倍型，共發(fā)現(xiàn)16個多態(tài)位點，得出9種單倍型，遺傳距離為0.000 0～0.006 3，10個黑棘鯛群體的平均單倍型多樣性（Hd）為0.393，平均核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為0.003 19，說明10個群體表現(xiàn)出了較低的Hd和較低的Pi，其中廈門群體的遺傳多樣性最大，這與廈門的地理位置及氣候有關。AMOVA模塊和系統(tǒng)進化樹均顯示來自10個群體黑棘鯛間遺傳分化不顯著，說明來自南北方的黑棘鯛屬于同一個管理單元，分子中性進化檢驗顯示舟山群體顯著偏離中性進化。[結論]該研究可為鯛科魚類的進化以及遺傳多樣性研究提供依據(jù)。

關鍵詞 黑棘鯛；16SrRNA；遺傳變異

中圖分類號 S917.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0122-05

Abstract [Objective]To compare 16S rRNA gene fragment of mitochondria from Acanthopagrus schlegelii.[Method]In this study， we used the 16S rRNA gene fragment of mitochondria from A.schlegelii to analyze the genetic diversity and genetic differentiation of 10 populations of wild A.schlegelii from the coast of China. [Result]The average content of bases A，C，G，T in 80 individuals in 10 groups was 31.6%，24.2%，22.7%，and 21.5%，respectively. A total of 9 haplotypes were defined， a total of 16 polymorphisms were found， and 9 haplotypes were obtained. The genetic distance was 0.000 0-0.006 3， the average Hd of 10 A. schlegelii groups was 0.393， and the average Pi was 0.003 19， indicating that 10 groups exhibit lower Hd and lower Pi， of which the Xiamen group had the largest genetic diversity. This was related to the geographical location and climate of Xiamen. Both the AMOVA module and the system evolution tree showed that the genetic differentiation between the A. schlegelii from 10 groups was not significant， indicating that the A. schlegelii from the North and South belonged to the same management unit， and the molecular neutral evolution test showed that the Zhoushan population was significantly deviated from the neutral evolution. [Conclusion]The study will provide evidence for the evolution and genetic diversity of A. schlegelii.

Key words Acanthopagrus schlegelii；16SrRNA；Genetic variation

黑棘鯛（Acanthopagrus schlegelii）又稱黑鯛，隸屬鱸形目（Percoidei）、鯛科（Sparidae）、棘鯛屬（Acanthopagrus），具有生長迅速、抗病能力強、適應能力強等特點。黑棘鯛肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟價值，是海水養(yǎng)殖的名貴經(jīng)濟魚類，廣泛分布在北太平洋西部，我國沿海以及朝鮮、日本海域[1]。目前，對黑棘鯛的研究主要集中在基礎生物學、增養(yǎng)殖學、疾病學和遺傳學等方面。

線粒體（mitochondrion）是細胞中的“動力工廠”，是一種非常重要的細胞器，是細胞中氧化磷酸化及主要的供能場所，是一種半自主細胞器。動物的線粒體DNA具有以下特點：基因排列非常緊湊、核苷酸組成不均一、遺傳行為較獨立、增殖較快以及密碼識別機制與核基因的編碼規(guī)律不盡相同[2-3]。線粒體16S rRNA基因在線粒體基因組中進化速度較適中，常被應用于不同階元物種的系統(tǒng)進化和分類研究[4]。目前國內關于黑棘鯛分子水平的研究有多方面，楊慧榮等[5]通過RAPD技術對3個不同地理群體黑鯛進行了群體內與群體間的遺傳變異分析；林勉等[6]采用核型分析和AFLP技術對黑鯛及其雜交子代進行了遺傳差異分析；郭昱嵩等[7]對9種常見鯛科魚類進行了微衛(wèi)星位點篩選和遺傳多樣性分析。筆者利用PCR擴增技術對黑棘鯛線粒體16S rRNA基因片段進行序列測定和分析，了解我國沿海10個群體野生黑棘鯛的遺傳差異，以期為今后黑棘鯛的遺傳選育及養(yǎng)殖生產提供分子遺傳學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的10個野生黑棘鯛群體分別采自煙臺、威海、舟山、福鼎、廈門、漳浦、南澳、湛江、北海和海口。采樣時間為2015年10月29日—2016年10月20日，具體采樣地點及時間見表1。試驗樣品加冰運送到實驗室，從黑棘鯛背部剪下肌肉組織，將其置于95%乙醇溶液中，存放于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1

DNA提取。試驗過程中，所用的基因組DNA均由試劑盒提取所得。提取過程嚴格按照說明書操作，具體步驟詳見海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒使用說明書（北京天根生化科技有限公司）。

1.2.2

DNA檢測。提取DNA，取2 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并經(jīng)K5500超微紫外分光光度計檢測其純度和濃度。選取純度較好、片段完整的DNA稀釋到100 ng/μL，放-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 黑棘鯛線粒體16S rRNA基因的PCR擴增。擴增引物選用F：5′-GGTAGGGCAATCACTTCTCT-3′和R：5′ -TAGCGGCTGGACCATTAGGA- 3′。 對其進行PCR擴增，PCR擴增反應總體系為50 μL，體系中各組分為DNA模板（100 ng/μL），2.5 μL；ddH2O，38.25 μL；10× Dream Taq buffer（Mg2+），5 μL；Primer F（10 μmol/L），1.25 μL；Primer R（10 μmol/L），1.25 μL；Dream Taq酶（5 U/μL），0.50 μL；dNTPs（10 mmol/L），1.25 μL。擴增的反應程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃保溫10 min。PCR擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4

基因片段的測序及數(shù)據(jù)分析。將PCR擴增產物送至上海英濰捷基公司測序，測序結果網(wǎng)上自行下載。結合DNAMAN 6.0軟件人工去除序列兩端的測序不可信堿基及非目的基因序列；運用BioEdit 7.0軟件對10個群體野生黑棘鯛的線粒體16S rRNA基因片段的核苷酸序列進行比對以分析堿基組成；運用DNA SP 5.10軟件分析各群體的單倍型數(shù)（number of haplotypes，h）、平均核苷酸差異數(shù)（average number of nucleotide differences，k）、核苷酸多樣性指數(shù)（nucleotide diversity，Pi）等；利用Arliquin 3.5軟件分析序列的遺傳多樣性、變異位點及序列單倍型。運用Arliquin 3.5軟件的AMOVA模塊分析得到遺傳變異在群體間和群體內的分布；最后，運用MEGA 4.0軟件構建10個野生黑棘鯛群體的NJ進化樹。

2 線粒體16S rRNA基因片段結果分析

2.1 序列特征及群體遺傳多樣性

通過計算16S rRNA基因序列發(fā)現(xiàn)，各堿基組成在黑棘鯛10個群體80個個體中無明顯差異。堿基組成A、C、G、T的平均含量分別為31.6%、24.2%、22.7%、21.5%，A+T平均含量為53.1%，G+C平均含量為46.9%（表2）。

在黑棘鯛10個群體80個個體中，共發(fā)現(xiàn)17個變異位點（total number of mutations），占439個分析位點數(shù)的3.87%，這其中包括1個堿基插入/缺失位點和16個多態(tài)位點（polymorphic site）。16個多態(tài)位點包括6個單一變異位點（singleton variable site）以及10個簡約信息位點（parsimony informative site），而這些突變位點一共定義了9種單倍型。

80個黑棘鯛個體的平均核苷酸差異數(shù)為1.401，核苷酸多樣性指數(shù)為0.003 19。在10個黑棘鯛群體中，廈門的平均核苷酸差異數(shù)最大，為2.143；核苷酸多樣性指數(shù)也最大，為0.004 88（表3）。

2.2 群體間遺傳變異分析

黑棘鯛10個群體間的遺傳距離為0.000 0～0.006 3，其中漳浦群體與廈門群體之間的遺傳距離最大，為0.006 3（表4）。

利用Arliquin3.5軟件基于距離矩陣 pairwise difference 計算群體間的遺傳分化系數(shù)FST。當FST為負值時，若P值大于0.05，則群體間并未出現(xiàn)顯著的遺傳分化；而FST為負值時，若P值小于0.05，則群體間出現(xiàn)顯著的遺傳分化。由表5可知，當群體間FST為負值時，P值均大于0.05。AMOVA分析也表明，黑棘鯛群體遺傳變異5.19%來自群體間，94.81%來自群體內。群體間的遺傳分化系數(shù)為0.051 91，P=0.000 00。說明黑棘鯛群體間未出現(xiàn)較為顯著的遺傳分化。

采用Tajimas D檢驗和Fus Fs檢驗對黑棘鯛群體進行中性進化檢驗。當Tajimas D檢驗所得D值為負值時，若P值大于0.05，則說明該群體并沒有顯著偏離中性進化，表明該群體的種群大小以及遺傳趨勢都趨于穩(wěn)定。而當Tajimas D檢驗所得D值為負值時，若P值小于0.05，則說明該群體顯著偏離中性進化。Tajimas D檢驗顯示10個野生黑棘鯛群體均未顯著偏離中性進化，F(xiàn)us Fs檢驗顯示，舟山群體顯著偏離中性進化，之前有研究表明Fus Fs檢驗較Fus Fs檢驗結果更加準確，所以10個黑棘鯛群體中，只有舟山群體顯著偏離中性進化（表6）。且根據(jù)序列距離構建10個野生黑棘鯛群體80個個體的NJ進化樹（圖1），可以看出NJ進化樹并無明顯分支，10個群體并沒有體現(xiàn)出地理差異性。

3 結論與討論

線粒體DNA進化速率較核DNA快，在生物中應用廣泛，線粒體16SrRNA基因具有適宜的進化速度，一般用于研究物種的分類和進化關系。目前，16SrRNA片段在多樣性及分子系統(tǒng)學研究中應用廣泛[8-9]，如羅氏沼蝦[10]、石鱸科魚類[11]、礁石珊瑚[12]等。但國內外關于黑棘鯛基于16SrRNA基因的分子水平研究較少，一些種屬的分類地位仍然沒有得到解決。

3.1 群體遺傳多樣性分析

10個黑棘鯛群體黑棘鯛A、C、G、T堿基組成在每個個體中相似，這與分析石首魚類[13]、黃姑魚[14]、中華虎頭蟹[15]等魚類的16S rRNA基因片段序列所得結果一致。共發(fā)現(xiàn)17個變異位點，比例為3.87%，該結果低于笛鯛屬魚類16S rRNA基因的結果，這可能與研究品種的差異、采樣范圍、所選取序列的片段及地理差異等有關。遺傳多樣性是多種學科的基礎，被廣泛運用在瀕危動植物的保護、種群遺傳、植物遺傳育種等方面，對其進行深入研究，有利于生物體的優(yōu)良進化。80個野生黑棘鯛個體的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為0.393（Hd<0.5），核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）為0.003 19（Pi<0.05），呈現(xiàn)較低的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，說明遺傳多樣性水平總體處于較低狀態(tài)。10個群體中，廈門黑棘鯛的遺傳多樣性最大，這與利用黑棘鯛Cytb基因片段研究結果相似，這可能與廈門優(yōu)良的氣候條件有關。廈門又稱“鷺島”，是東南沿海重要的中心城市，由鼓浪嶼等許多小島嶼組成，海域終年水溫較高，陽光充足，營養(yǎng)鹽含量豐富，適合多種海洋生物的生存，前后共記錄的海洋生物有2 000多種。黑棘鯛16S rRNA基因進化速率很慢，是一個相對保守的序列，其在不同群體間的分化程度均很低，不能有效檢測到群體間的差異，不適合作為研究其多樣性的工具，這與羅氏沼蝦16S rRNA片段所得結論一致[16]。

全球性的氣候變化和環(huán)境污染、人們對近海無節(jié)制開發(fā)以及為了一些商業(yè)利益對黑棘鯛野生群體進行大規(guī)模捕撈等均造成了野生黑棘鯛棲息地的破壞，導致其多樣性水平降低。近年來，對黑棘鯛的人工標志放流技術逐漸成熟，在2017年6月6日，八閩放魚日當天，包括黑棘鯛在內的4.5億魚苗得到放流，有助于改善魚類多樣性及生態(tài)水域環(huán)境，但不正確的放流將會使群體的多樣性降低，如魚苗的過量投放，超出了該海域的環(huán)境容納量，甚至尸體還會對水體環(huán)境造成污染，對原有的野生黑棘鯛造成了不利影響，有的外來物種甚至會破壞地區(qū)的生態(tài)破壞，這就使得原有種的遺傳多樣性降低。同樣過度捕撈也會降低物種的遺傳多樣性，歷史上黑棘鯛曾受到過較高的捕撈壓力，使得黑棘鯛群體在短期內迅速減少，即經(jīng)歷了遺傳瓶頸效應，這與高天翔等[17]研究2種魚類Cytb、16S rRNA片段序列得出的結論一致。所以要想恢復其多樣性，必須遵從一定的增殖放流規(guī)定，放流前要對該海域的生態(tài)環(huán)境及環(huán)境容納量做仔細研究，不可擅自隨意放流。

3.2 黑棘鯛群體間的遺傳變異分析

我國沿海10個野生群體的遺傳距離是0.000 0～0.006 3，黑棘鯛親緣關系的遠近和其所處的地理位置沒有明顯的關系，有學者基于線粒體控制區(qū)對12個黑棘鯛群體的遺傳分化及系譜結構進行了分析，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的地理群聚和系譜結構[18]；對來自我國沿海5個地理位置的黑棘鯛進行遺傳分化研究，發(fā)現(xiàn)進化樹無明顯的系譜分支[19]，這與該研究的遺傳分化結果一致。

遺傳分化系數(shù)FST是遺傳分化研究中一個有效指標，F(xiàn)ST大小反映了各群體間相似性的大小，F(xiàn)ST越大則說明群體間的相似性越小，反之，則說明相似性較大。該研究發(fā)現(xiàn)，舟山和福鼎群體之間遺傳分化系數(shù)FST為負值，P大于0.05，表明10個群體間并沒有出現(xiàn)顯著的遺傳分化。遺傳分化系數(shù)FST為負值的情況在文昌魚[20]、長蛸[21]的研究中均有發(fā)現(xiàn)，這是由于群體內的遺傳分化和群體間不均衡造成的，群體內的大很多。結合AMOVA模塊也可以得出，10個群體的遺傳分化均屬種內水平，并未出現(xiàn)種間水平的分化，黑棘鯛遺傳變異在群體間和群體內分別為5.19%、94.81%，群體間遺傳分化系數(shù)FST為0.051 91，P為0.189（P>0.05），說明我國沿海10個野生黑棘鯛群體間并未出現(xiàn)顯著的遺傳分化，各海域的黑棘鯛之間存在著較大基因交流，這與AFLP的研究結果一致。

3.3 分子中性進化分析

分子中性進化采用Tajimas D和Fus Fs檢驗。當種群處于平衡選擇時，Tajimas D 值大于0；當群體受到外界環(huán)境的負選擇、瓶頸效應和搭載效應等情況影響時，D值小于0。Tajimas D結果顯示，10個群體顯示D值小于0，P大于0.05，說明我國沿海10個野生黑棘鯛群體并未顯著偏離中性進化。

Fus Fs檢驗是另一種基于種內多態(tài)性的中性檢驗，F(xiàn)u等[22]研究表明在中性假說檢驗方面，F(xiàn)us Fs檢驗可能比Tajimas D檢驗更加靈敏。Fus Fs法分析發(fā)現(xiàn)，舟山群體偏離中性進化比較顯著。這說明，舟山群體在歷史上由于環(huán)境劇烈惡化，為了后代的生存發(fā)育，可能經(jīng)歷了大規(guī)模的遷移，向一個環(huán)境較好的水域移動，這樣就造成種群的大規(guī)模擴張，大量黑棘鯛涌入一個新海域，會發(fā)生瓶頸效應，即生物的個體數(shù)目及遺傳信息含量在短時間內急劇下降，這樣就會偏離中性進化；即使日后進行再次擴張，也只會達到原海域黑棘鯛的數(shù)目而生物體內的遺傳變異是遠遠達不到以前的水平，從而產生了遺傳漂變，而其他9個野生黑棘鯛群體的遺傳趨勢和大小趨于穩(wěn)定。

3.4 10個群體黑棘鯛的系統(tǒng)發(fā)生關系

根據(jù)序列距離構建10個野生黑棘鯛群體80個個體的NJ進化樹，可以看出該進化樹未形成明顯的地理結構，與各群體所處的地理位置無關。目前，針對其群體劃分存在2種說法：一種認為南北方黑棘鯛共屬同一個祖先，遺傳分化不顯著，可以歸為同一個管理單元；另一種是認為南北黑棘鯛間存在明顯的遺傳分化，應該分為南、北方2個不同的管理單元，該研究顯示南北方群體間的遺傳分化并不顯著，存在較強的基因交流。

近年來由于黑棘鯛種質資源遭到破壞，為了加大對黑棘鯛的保護，養(yǎng)殖業(yè)非常發(fā)達，人工選育以及雜交造成了非常嚴重的基因滲透和基因混雜。養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展有助于黑棘鯛增殖放流活動的順利進行，為了提高其多樣性，將養(yǎng)殖的黑棘鯛投入野生黑棘鯛生存海域，雖然提高了其多樣性，但是也造成了一定程度的基因交流。有研究表明，地球上現(xiàn)存海洋生物的種群結構在很大程度上會受到以往地理歷史事件的影響，在晚更新世紀冰期以來，地球經(jīng)歷了一系列的間冰期和冰期的周期性變化，導致氣候和和海域面積也會在特定時間發(fā)生變化，這樣就形成了不同海域之間生物的基因交流。該研究所采集的野生黑棘鯛樣品來自多個海域，有資料表明它們在第四紀冰期曾經(jīng)歷了多次海進和海退，由于氣候變化、地球自轉速度變化及海面和陸地差異的變化等原因，造成海水反復多次從海洋向大陸擴展或是由大陸向海洋退縮，期間伴隨著生物群落的多次交換，這樣就造成了大面積、高強度的基因交流，甚至在盛冰期期間，多個海域出現(xiàn)了海水枯竭現(xiàn)象，導致了生物多樣性的降低，正是由于第四紀冰期以來，多個海域反復的海進和海退，使得野生黑棘鯛的棲息地隨之不斷發(fā)生變化，造成了如今黑棘鯛群體間廣泛的基因交流及遺傳均質性。

4 展望

雖然未顯示黑棘鯛群體的遺傳多樣性有劇烈的下降，但保護黑棘鯛的種質資源也是尤為重要的，可以從以下幾個方面入手，為野生黑棘鯛資源的合理開發(fā)及保護提供必要的參考。

（1）號召各地舉行定期的增殖放流，有助于改善水體環(huán)境，維持其生物多樣性，比如每年6月6日的八閩放魚日，在增殖放流時要采取正確的方法，切忌盲目隨意放流，遵從該地區(qū)的最大環(huán)境容納量，一旦超過環(huán)境容納量，則會打破原有的生態(tài)平衡，對野生黑棘鯛群體產生負面影響。在具體實施過程中，要注意放流高度，民間放生要提前向有關部門申請。

（2）要保證人類的工業(yè)活動不會對野生黑棘鯛的洄游通道造成影響，比如在修建大壩時候，一定要考慮魚類的洄游通道不被堵塞。

（3）建立相關法律、法規(guī)禁止過度捕撈，因為黑棘鯛具有一定的經(jīng)濟價值，每年都有許多人對其進行過度捕撈，政府應當加大對這些人的處罰力度，使黑棘鯛的數(shù)目相對穩(wěn)定。

（4）加大對水體環(huán)境的保護，避免將工業(yè)、生活廢水直接排入海域，這樣會對野生黑棘鯛賴以生存的環(huán)境造成影響，影響其產卵和孵化，進而使其多樣性慢慢降低，可以通過社區(qū)宣講、設立警示標語等方法。

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