擬南芥SSP1基因GFP載體構建及GFP植株篩選

吳席 樊婷婷 方雪

摘要 [目的]以野生型擬南芥為材料構建SSP1基因GFP載體及GFP轉基因植株。[方法]通過提取野生型擬南芥的RNA，反轉錄成為cDNA，并以cDNA為模板，利用高保真酶，進行SSP1基因的克隆，將克隆所獲得SSP1基因和pXB94-GFP質粒進行雙酶切，利用T4-DNA ligase進行連接，并轉化進大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，通過菌落PCR和測序獲得陽性單克隆。通過質粒抽提試劑盒提出構建好的重組質粒，并將其轉入農桿菌GV3101中，通過菌落PCR鑒定出陽性單菌落。將獲得的陽性菌通過花序浸染法轉入野生型擬南芥中，并通過抗性篩選獲得陽性植株。[結果]克隆SSP1基因成功，菌落PCR顯示SSP1基因成功連接到pXB94-GFP質粒上并成功轉入農桿菌中，抗性篩選獲得了SSP1-GFP轉基因植株。 [結論]成功獲得SSP1-GFP轉基因植株，為接下來進一步研究SSP1基因功能奠定了基礎。

關鍵詞 擬南芥；SSP1；載體；GFP轉基因植株

中圖分類號 Q939.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0119-03

Abstract [Objective]To build up the vector of Arabidopsis SSP1GFP and transgenic lines. [Method]Reverse transcription to cDNA by extracting the RNA of wild type Arabidopsis. The CDS fragment of SSP1 gene was amplified by PCR. After treatment with restriction enzymes and T4DNA ligase， the gene was connected to plasmid. Transfer the connection product to DH5α and a positive clone was identified. Then， transfer the recombinant to GV3101. The floraldip method was used to transfer it into wild type Arabidopsis. Finally， we obtained positive plants through resistance screening.[Result]We succeeded in cloning SSP1 gene. The recombinant plasmid was obtained and we got the transgenic lines. [Conclusion]The successful acquisition of SSP1GFP transgenic lines laid the foundation for further research on the function of SSP1 gene.

Key words Arabidopsis；SSP1；Vector；GFP transgenic lines

土壤鹽堿化是世界范圍內限制農業(yè)發(fā)展和作物生產的重要因素之一，探索鹽脅迫的作用機理以及提高植物抗鹽性的途徑具有重要的理論和實際意義[1-3]。尋找提高植物抗鹽性的關鍵基因并利用轉基因技術對植物品種進行優(yōu)化改良是解決上述問題的一種行之有效的方法 [4-7]。筆者通過鹽脅迫篩選試驗發(fā)現SSP1基因可以使擬南芥對鹽脅迫有所響應。通過克隆SSP1基因，并通過基因工程手段構建SSP1-GFP轉基因植株，以進一步探究SSP1基因在擬南芥響應鹽脅迫中所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料。

植物材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana），購于美國擬南芥種質資源中心，均為哥倫比亞（Columbia，Col）遺傳背景，后由合肥工業(yè)大學植物分子生物學實驗室繁殖所得。

1.1.2 試劑。

TIANprep Mini Plasmid Kit Ⅱ（TIANGEN）、T4-DNA Ligase（NEB）、 PrimeScript RT-PCR Kit （TaKaRa）、限制性內切酶Xho I（NEB）、EcoR I（NEB）、TransStart FastPfu DNA Polymerase ETransGen、壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素。

1.1.3 宿主和載體。

大腸桿菌DH5α，農桿菌GV3101，載體pXB94-GFP。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥無菌苗培養(yǎng)。

配制MS固體培養(yǎng)基，從冰箱里取出MS培養(yǎng)基放置至室溫，稱取所需要的組分放入三角瓶中，加入所需ddH2O，用5 mol/L NaOH溶液調節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8，用封口膜封好，121 ℃、25 min高溫高壓蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，將培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后即可播種。將消毒后的擬南芥種子于濾紙上晾干，種子晾干以后按試驗需要用牙簽蘸取點在培養(yǎng)皿上，待一個培養(yǎng)皿播種完成后，用封口膜將培養(yǎng)皿封好；將播種完成后的培養(yǎng)皿倒置于4 ℃冰箱中春化2～3 d，再放入溫室中豎直培養(yǎng)14 d。

1.2.2 擬南芥cDNA獲取。

提前將研缽清洗干凈，然后用錫紙包裹起來，置于180 ℃的烘箱中，高溫烘烤足夠時間；試驗之前要提前將所用試劑如氯仿、無水乙醇、異丙醇等放入-20 ℃冰箱中預冷；稱取所需材料100 mg左右，置于研缽中，加入適量液氮進行充分研磨；向研磨破碎后的材料中加入Trizol裂解液1 mL，立即快速研磨直至全部融化；轉移研磨完成后的材料到1.5 mL離心管中，于超凈臺中靜置5 min，置于冷凍離心機中4 ℃離心5 min，轉速13 000 r/min，小心吸取上清至另一新的1.5 mL EP管中；向1.5 mL EP管中加入200 μL預冷后的氯仿，劇烈振蕩15 s，置于超凈臺靜置5 min；利用冷凍離心機4 ℃離心15 min，轉速為13 000 r/min，吸取上層水相中的上清液至新的1.5 mL離心管中（切勿吸取到中間層物質，否則會造成DNA污染）；向EP管加入500 μL預冷后的異丙醇，輕輕顛倒混勻，于超凈臺靜置15 min；使用冷凍離心機4 ℃離心15 min，轉速為13 000 r/min，小心棄除上清，沉淀即為RNA；使用75%乙醇1 mL清洗沉淀；

冷凍離心機8 000 r/min，4 ℃離心5 min，盡可能棄去上清，于超凈臺室溫干燥10 min，使乙醇揮發(fā)干凈；向離心管中加入40 μL的RNase-ddH2O溶解，并放入65 ℃的水浴中10 min，使RNA沉淀充分溶解，溶解后吸出少量立即檢測其濃度與純度；檢測其濃度與純度后，根據結果將所得RNA按反轉錄試劑盒操作反轉錄成cDNA。

1.2.3 SSP1基因的克隆。

利用Primer 5.0軟件設計以下引物進行基因克隆，上游引物FP1：5′-CCGCTCGAGATGGCTGAGGTGGGAAAAG-3′，下游引物RP1：5′-CCGGAATTCTTAGCTTTGGGCAGGCTCTGT-3′，以獲得的cDNA為模板進行基因克隆。

1.2.4 酶切、連接及菌落PCR鑒定。

將克隆獲得的SSP1基因和pXB94-GFP質粒用限制性內切酶Xho I和EcoR I進行雙酶切，并利用T4-DNA Ligase進行連接，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α，并涂布于含有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進行菌落PCR鑒定。菌落PCR鑒定引物為上游引物F2：5′-TTCGCAAGACCCTTCCTCTA-3′，下游引物RP2：5′-TTAGCTTTGGGCAGGCTCTGT-3′。

1.2.5 花序浸染法獲取轉基因擬南芥。

將構建成功的重組質粒通過電擊轉化法轉化入農桿菌GV3101中，并通過菌落PCR鑒定陽性單克隆，挑取陽性克隆進行培養(yǎng)，配制浸染液，進行花序浸染，隔7 d，再次進行浸染。將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進行抗性篩選，獲取陽性植株。

2 結果與分析

2.1 擬南芥SSP1基因的克隆

將野生型擬南芥的種子經過消毒以后播種于MS培養(yǎng)基上，并于4 ℃春化 3 d，置于植物培養(yǎng)間培養(yǎng)14 d，用獲得的野生型擬南芥提取總RNA，利用反轉錄試劑盒反轉成cDNA。以稀釋5倍后的cDNA為模板，通過PCR技術擴增SSP1基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，擬南芥網站顯示SSP1基因CDS全長為1 392 bp，與電泳結果一致，說明SSP1克隆成功。

2.2 目的片段和質粒雙酶切

前期引物設計時，已經在基因克隆上下游引物上分別添加了Xho I和EcoR I的酶切位點，所以使用限制性內切酶Xho I和EcoR I對通過基因克隆獲得的SSP1基因和pXB94-GFP質粒同時進行雙酶切。酶切以后進行電泳檢測獲得結果如圖2所示。

2.3 連接和大腸桿菌轉化后陽性克隆鑒定

將獲得的雙酶切以后的SSP1基因和pXB94-GFP質粒用T4-DNA Ligase酶進行連接，16 ℃連接16 h，將獲得的連接產物轉化入大腸桿菌DH5α中，待長出單克隆以后，挑取單克隆進行PCR驗證，菌落PCR鑒定結果如圖3所示。PCR條帶與目的條帶大小一致，說明其為陽性克隆，對陽性克隆進行測序以后，與SSP1CDS序列進行比對，結果完全一致，說明SSP1-GFP重組質粒構建成功。

2.4 農桿菌轉化及花序浸染

將SSP1-GFP重組質粒通過電擊轉化法轉化入農桿菌GV3101，待其長出單菌落以后進行菌落PCR驗證，電泳結果如圖4所示，獲得陽性單克隆。將陽性單克隆進行擴培，并通過花序浸染法，對開花期的野生型擬南芥進行轉基因。

2.5 SSP1-GFP轉基因植株的抗性篩選

獲取通過花序浸染法進行轉基因后的擬南芥種子，將獲得的種子消毒以后播種在含有卡那霉素抗性的MS平板上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，長出來的小苗（具有根，子葉顏色嫩綠）就是轉基因陽性植株，如圖5所示，將轉基因陽性植株移至土壤中置于溫室中進行培養(yǎng)，待植株果莢成熟以后，單株收取種子，進行后續(xù)試驗。

3 討論

鹽脅迫是自然界中主要的幾種非生物脅迫之一，其對農作物產量有極大的影響，且對生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定造成威脅。迄今為止，全球范圍內約有鹽堿化土地950萬hm2，我國的鹽堿化土地面積約為270萬hm2 [8]。一旦土壤中的可溶性鹽超標，就會對生長在其上的大部分植物造成傷害。鹽脅迫包括滲透脅迫和離子脅迫以及由此引起的次級脅迫如氧化脅迫等，這一系列的影響可能會造成植物生長滯緩，甚至死亡[9-18]。

利用轉基因技術對植物品種進行優(yōu)化改良是應對植物鹽脅迫的一個重要方法[19-21]，因此應致力于尋找提高植物抗鹽性的關鍵基因。前期結果顯示SSP1基因參與了植物對鹽脅迫的響應，因此通過構建SSP1-GFP轉基因植株，對SSP1基因的功能進行進一步探究，以期進一步解析SSP1基因在植物對鹽脅迫響應中所起的作用。

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