蓖麻毒素結(jié)構(gòu)及其活性檢測方法研究進(jìn)展

劉寧　張柏林　竇全麗　王雙雙

摘要 對蓖麻毒素結(jié)構(gòu)及活性檢測方法進(jìn)行綜述，從而為蓖麻毒素的深入研究、選擇合適的蓖麻毒素活性測定方法提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 蓖麻；蓖麻毒素；結(jié)構(gòu)；活性檢測

中圖分類號 S565.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）18-0033-03

Researches Advances of Ricin Structure and the Detection Methods of Its Activity

LIU Ning， ZHANG Bolin， DOU Quanli et al （Department of Agricultural and Biotechnology of Zunyi Normal Colleage，Zunyi，Guizhou 563006）

Abstract This paper reviewed the structure of ricin and its detection methods，and provided the basis for furtherly researching the ricin and selecting suitable methods for measuring ricin activity.

Key words Castro；Ricin；Structure；Activity detection

蓖麻是大戟科蓖麻屬植物，為含油量較高的油料作物[1]。但蓖麻植株的莖、葉或蓖麻的籽實中含有有毒物質(zhì)，主要包括蓖麻毒素、蓖麻堿、蓖麻反應(yīng)原及蓖麻血球凝集素等[2]。其中，蓖麻毒素也稱蓖麻毒蛋白，是迄今所知毒性最強(qiáng)的植物毒蛋白，毒性約是氰化物的6 000倍[3]。蓖麻毒素主要存在于蓖麻蛋白中，在干燥種子、脫脂籽實及幼嫩新鮮莖葉中含量分別達(dá)3.3%、2.0%～3.0%及0.7%～1.0%。蓖麻毒素為白色粉末或結(jié)晶固體，在25 ℃時，可在較大范圍的酸堿溶液中反復(fù)結(jié)冰和溶解，但其毒性仍保持不變[4]。因此，建立蓖麻毒素快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。筆者對蓖麻毒素結(jié)構(gòu)及檢測方法進(jìn)行綜述，以期為選擇合適的蓖麻毒素檢測方法及研究蓖麻毒素新的檢測技術(shù)提供參考。

1 蓖麻毒素的結(jié)構(gòu)

蓖麻毒素（約占蓖麻蛋白的5%，分子量約為66 kD）是一種 Ⅱ 型異二聚體核糖體失活蛋白，由核糖體失活酶（蓖麻毒素A鏈）及與半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特異結(jié)合的凝集素（蓖麻毒素B鏈）組成，二者之間連接一個二硫鍵[5-7] （圖1）。對蓖麻毒素的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)， A鏈含有267個氨基酸殘基，分子量約為32 kD，具有催化活性，是蓖麻毒素蛋白的效應(yīng)鏈。A鏈中N端第4位及C端附近分別含有1個賴氨酸（Lys）殘基，是蓖麻毒素A鏈毒性作用的關(guān)鍵中心。B鏈具有2個結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)域具有同源性，由基因復(fù)制產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)域1中含有氨基末端，而結(jié)構(gòu)域2中含有羧基末端。蓖麻毒素B鏈由267個氨基酸殘基組成，具有結(jié)合活性，是蓖麻毒素的結(jié)合鏈[6，8]。

1.1 A鏈結(jié)構(gòu)

蓖麻毒素A鏈為球形，含有8個α螺旋及8個β-折疊片層。核糖體失活蛋白家族均存在固定的8個氨基酸序列，這些氨基酸序列均存在于其活性位點中，包括酪氨酸80、酪氨酸123、谷氨酸177、精氨酸180、色氨酸211[9-11]。其中，精氨酸180與N3結(jié)合，而谷氨酸177位于核糖體附近[6]。Day等[12]研究表明， 谷氨酸177 和 精氨酸180對A鏈的活性有很大影響，若其中一個發(fā)生突變， A鏈的活性則受到較大影響，說明氨基酸的保守對其活性發(fā)揮具有重要作用。

蓖麻毒素的A鏈除具有鈍化核糖體的功能外，也具有催化活性[13-14]。A鏈?zhǔn)且环N能從28S核糖體RNA 中脫去腺嘌呤的糖苷酶，毒素本身不能破壞RNA鏈的活性，即使在堿性環(huán)境和有苯胺存在的酸性環(huán)境下，脫嘌呤作用仍非常敏感[15]。蓖麻毒素A鏈的酶活性很高，一分子蛋白在1 min內(nèi)可以鈍化幾千個核糖體，遠(yuǎn)超過細(xì)胞的再生速度，可以殺死多個動物細(xì)胞[16]。

1.2 B鏈結(jié)構(gòu)

蓖麻毒素B鏈呈啞鈴狀，含2個半乳糖結(jié)合位點，能與細(xì)胞膜表面的半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特異性結(jié)合[17]。B鏈與β-D-半乳糖結(jié)合，且折疊成2個球形，每個含有1個結(jié)合位點。一般B鏈組成上有一系列的基因重復(fù)，它們都是由3種遺傳性的半乳糖結(jié)合肽段α、β和γ組成，其中只有1α 和2γ能與半乳糖結(jié)合，通常與糖蛋白、糖脂上的碳水化合物配位子結(jié)合，因此一般在細(xì)胞上有成千上萬的結(jié)合位點[18]。但當(dāng)2個球形都發(fā)生突變時，蓖麻毒素B鏈則會失去活性，無法與細(xì)胞發(fā)生凝集。蓖麻毒素B鏈 單個氨基酸的改變可能影響其與受體的結(jié)合。研究表明，將蓖麻毒素B鏈255位的天冬酰胺換成丙氨酸，盡管其仍能與A鏈以二硫鍵連接，且具有相似的分子量，但與野生型的B鏈相比，其凝集活性降低了99%[19]。蓖麻毒素B鏈單獨存在時無毒性，只有在結(jié)合半乳糖/ N-乙酰基半乳糖胺時才發(fā)揮毒性。蓖麻毒素B鏈毒性作用的發(fā)揮可能由以下原因引起：①RTB鏈可與細(xì)胞表面的半乳糖或甘露糖的受體結(jié)合，使A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生毒性作用；② 蓖麻毒素B鏈與半乳糖殘基結(jié)合后，經(jīng)逆向轉(zhuǎn)運作用將蓖麻毒素運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后釋放出具有酶活性的A鏈，進(jìn)而發(fā)揮毒性作用[20]。

2 蓖麻毒素的檢測方法

蓖麻毒素具有很強(qiáng)的毒性作用，毫克級的劑量即可致人或動物死亡[21]。但截至目前，適用于人的解毒藥和特異性抗毒素特效藥尚未被研制出來。因此，建立快速有效的檢測方法成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。根據(jù)蓖麻毒素的理化性質(zhì)、生物化學(xué)特性及免疫學(xué)特性，建立了免疫吸收分析、生物傳感器分析及生物質(zhì)譜分析等方法。

2.1 免疫標(biāo)記分析法

免疫標(biāo)記方法是將抗原或抗體進(jìn)行生物學(xué)標(biāo)記，利用蓖麻毒素抗原位點能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的特點而建立的檢測方法， 是檢測蓖麻毒素最常用的技術(shù)手段[22-23]。常用的免疫抗體標(biāo)記方法有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金標(biāo)記法及放射免疫法。Poli等[22]利用自制的抗體（以羊為抗體制備動物制得）進(jìn)行研究，結(jié)果表明， ELISA方法可檢測到生物樣品中微克級的蓖麻毒素。王宗義等[24]通過進(jìn)一步研究，建立了夾心ELISA方法，檢出限可達(dá)2.5 ng/mL。

早期酶聯(lián)免疫吸附法主要采用多克隆抗體，可能存在一定程度上的交叉反應(yīng)，影響檢測結(jié)果的精確性。而單克隆抗體是利用某一抗原表位為抗體，具有特異性較高的特點。因此，以單克隆抗體為基礎(chǔ)的蓖麻毒素檢測方法，是快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、實用的定量檢測方法。劉文森[25]利用膠體金技術(shù)標(biāo)記所制備的單克隆抗體，進(jìn)行檢測試劑條的制備。結(jié)果表明，隨著蓖麻毒素濃度的增加，膠體金試劑條的顏色逐漸減弱，試劑條的檢測靈敏度可達(dá)10 μg/mL，滿足檢測需求。

2.2 放射免疫檢測法

隨著生物標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，研究者成功建立了放射免疫檢測方法。該方法主要是利用抗原-抗體特異性結(jié)合而進(jìn)行體外超微量蓖麻毒素檢測，具有高度靈敏性、精確性的特點。放射免疫方法可檢測出樣品中100 pg數(shù)量級的蓖麻毒素[26]，適用于對蓖麻毒素中毒者血液中蓖麻毒素含量的檢測。但該方法的缺點是操作處理比較繁瑣，對設(shè)備的要求比酶聯(lián)免疫法高，且對人員的專業(yè)性要求較高及放射元素的處理等條件限制了該方法的廣泛應(yīng)用[27]。

2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜檢測將待測物質(zhì)溶于流動相中，利用色譜柱固定相將流動相的組成進(jìn)行分離，對檢測器收集到的峰信號轉(zhuǎn)換為待測物質(zhì)濃度，進(jìn)而來判定待測物質(zhì)含量的一種方法，具有速度快、分辨率高、靈敏度高等特點[28]。劉文森[25]采用PROTEIN KW-802.5凝膠色譜柱，在柱溫25 ℃、流速1 mL/min、進(jìn)樣量10 μL的條件下進(jìn)行蓖麻毒素檢測條件的建立。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒素在波長280 nm條件下具有最大的吸收峰，出峰時間約為8.96 min，在0.093～5.970 μg具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限達(dá)23.33 ng。

2.4 生物傳感法

生物傳感器是將生物技術(shù)和電子技術(shù)聯(lián)合使用，將待測物與識別元件特異性結(jié)合后產(chǎn)生的生物敏感物質(zhì)的化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴⒐庑盘柕?，從而達(dá)到分析檢測目的[8]。該方法無需特殊標(biāo)記物，具有選擇性好、操作簡單、實時在線監(jiān)測的特點，是醫(yī)學(xué)診斷、食品衛(wèi)生檢驗等領(lǐng)域安全快速檢測的研究熱點[29]。劉冰等[29]利用壓電免疫傳感進(jìn)行蓖麻毒素檢測，結(jié)果表明，該方法對蓖麻毒素具有較高的靈敏度檢測范圍，可達(dá)0.50～10.0 mg/L。隨著量子點的發(fā)展，免疫傳感檢測技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展。Goldman等[30]基于量子點技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒素的檢測極限值可達(dá)30 ng/mL。

2.5 生物質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）及電噴霧等技術(shù)為分析極性強(qiáng)、難揮發(fā)等特點的生物樣品提供了可靠條件[31]。肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass fingerpritin，PMF）是利用特異性蛋白酶對不同蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行水解處理后得到具有獨特特征的肽混合物，稱其為指紋譜。該方法是目前進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的常用方法[32]。將待測蛋白質(zhì)樣品經(jīng)垂直板電泳或二維電泳分離，經(jīng)酶切、肽段提取后，將所得的肽段混合物進(jìn)一步分離，通過電噴霧-質(zhì)譜技術(shù)在線測定蛋白質(zhì)的肽譜，從而實現(xiàn)鑒定。該方法不需要進(jìn)行肽混合物的分離，具有操作簡單、分析快速及靈敏度高的特點[31]。閆妍[31]將分離后的蓖麻毒素凝膠進(jìn)行酶切和肽片段提取后，對所得的肽混合物進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，將所測肽片段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在SwissProt或NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PMF檢索比對，得到蓖麻毒素的序列覆蓋率達(dá)35%。

3 小結(jié)

由于蓖麻毒素具有較強(qiáng)的毒性，且可能作為重要的生物恐怖戰(zhàn)劑毒素被應(yīng)用于戰(zhàn)爭中，受到各國政府及科研工作者的重視。因而，建立快速、準(zhǔn)確的測定方法，以便為疑似樣品及中毒人員進(jìn)行快速檢測及治療提供技術(shù)支持。目前蓖麻毒素檢測方法較多，應(yīng)用也較廣泛，但尚存在一定的不足：①免疫標(biāo)記及放射免疫方法具有檢測靈敏度高的特點，但其對于相對繁雜的抗體制備及特殊標(biāo)記物的要求，限制了該方法的大量推廣應(yīng)用；②生物傳感法及生物質(zhì)譜法，雖然借助于高科技的儀器設(shè)備，具有靈敏度高的特點，但高昂的儀器設(shè)備使得檢測費用大大增加，不適合做現(xiàn)場檢測。因此，建立快速、準(zhǔn)確的試劑條檢測方法，以便應(yīng)對緊急檢測及現(xiàn)場檢測的需求，將成為蓖麻毒素檢測方法的研究重點，從而為臨床治療提供理論依據(jù)。

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