不同病原菌脅迫下青蛤血淋巴轉(zhuǎn)錄組中免疫相關(guān)基因的比較

趙婷 潘寶平

摘要 利用病原微生物革蘭氏陽性藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和革蘭氏陰性鰻弧菌（Vibrio anguillarum）分別侵染活體青蛤，采用第二代測序MiSeq技術(shù)測序，構(gòu)建了青蛤血淋巴中應(yīng)答2種病原物的轉(zhuǎn)錄組文庫。根據(jù)KEGG等數(shù)據(jù)庫注釋信息對Unigene進(jìn)行生物學(xué)通路注釋，預(yù)測出青蛤免疫信號通路的差異性表達(dá)基因及相關(guān)注釋信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共注釋并篩選出2 605個(gè)差異表達(dá)基因，其中893個(gè)基因注釋到15個(gè)免疫相關(guān)的通路中。該研究可為探索青蛤的免疫識別方式和信號傳導(dǎo)路徑提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 青蛤；轉(zhuǎn)錄組文庫；鰻弧菌；藤黃微球菌；免疫相關(guān)基因

中圖分類號 S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0084-04

Comparison of Immunerelated Genes in Transcriptome Library of Cyclina sinensis Hemolymph under the Stress of Different Pathogenic Bacteria

ZHAO Ting1， PAN Baoping2

（1.Tianjin Medical College， Tianjin 300222；2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387）

Abstract Cyclina sinensis were injected with Micrococcus luteus and Vibrio anguillarum respectively.

Using the Illumina Miseq system of secondgeneration sequencing technology， two transcriptome library of hemolymph was constructed. Unigene could be annotated to biological pathway by KEGG database to predict differential expression network of immune signaling pathway in C. sinensis. The results showed that 2 605 differentially expressed genes were found and a total of 893 genes annotated to 15 immune related pathways. This research could provide basis for exploring immune recognition and signal transduction pathway in C. sinensis.

Key words Cyclina sinensis；Transcriptome library；Vibrio anguillarum；Micrococcus luteus；Immunerelated genes

基金項(xiàng)目 天津市科委應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目（12JCZDJC22800）。

作者簡介 趙婷（1988—），女，山東煙臺人，助教，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事軟體動物分子系統(tǒng)學(xué)、海產(chǎn)貝類養(yǎng)殖與病害防治工作。

收稿日期 2018-06-05

青蛤養(yǎng)殖是我國傳統(tǒng)的海濱經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，蘊(yùn)含著巨大的發(fā)展前景[1]。近年來，由于青蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中出現(xiàn)的高密度投放、種質(zhì)退化及養(yǎng)殖環(huán)境污染等問題，屢次發(fā)生病害及大面積死亡現(xiàn)象，給青蛤養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]，有關(guān)貝類病害問題已成為制約貝類養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。青蛤的病害防治應(yīng)從外因和內(nèi)因2個(gè)方面入手，外因方面要求改善貝類的養(yǎng)殖環(huán)境，內(nèi)因方面則要求提高貝類自身的抗病能力，即通過分子免疫學(xué)技術(shù)尋找物種的免疫相關(guān)基因和探索免疫應(yīng)答機(jī)制，最終揭示貝類的免疫調(diào)控分子機(jī)制并為抗病品系選育提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

目前，有關(guān)貝類轉(zhuǎn)錄組的研究已成為貝類免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，亦成為研究者獲得大量免疫抗病基因的有效途徑之一。Hou等[5]通過454 高通量測序方法對蝦夷扇貝成體各組織和各發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，一些與免疫、抗逆性、生長和繁殖相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，為蝦夷扇貝的基因組研究和遺傳提供重要的平臺。Huan等[6]將文蛤不同發(fā)育階段的幼蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析了文蛤 4 個(gè)幼蟲發(fā)育階段的表達(dá)差異，通過對序列拼接及基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)與生長、發(fā)育及免疫相關(guān)的基因。結(jié)合文獻(xiàn)檢索結(jié)果和GenBank中注冊青蛤EST的情況可知，國內(nèi)外對青蛤免疫功能基因的研究剛剛起步[7]，因此構(gòu)建青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫大規(guī)模進(jìn)行測序是十分必要的。筆者采用第二代測序技術(shù)對在不同病原物刺激下的青蛤血淋巴轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較，以期為揭示青蛤的免疫應(yīng)答與免疫調(diào)控機(jī)制提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)，同時(shí)也為青蛤養(yǎng)殖實(shí)踐中的病害防治策略提供新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從天津大港海灘沿岸采集的青蛤作為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選取沒有損傷、形態(tài)大小一致的青蛤樣品，暫養(yǎng)于通氧氣的海水中，海水密度約1.030 g/cm3，溫度保持在22 ℃左右，海水pH 7.0，投喂5‰的小球藻，7 d后做建庫試驗(yàn)準(zhǔn)備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 侵染試驗(yàn)。

鰻弧菌在28 ℃條件下用2216E大量培養(yǎng)菌株，藤黃微球菌在37 ℃條件下用LB大量培養(yǎng)菌株，分別進(jìn)行菌液制備。24 h后菌液渾濁，經(jīng)轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，將2種菌體分別用過濾滅菌的海水清洗3次，去除多余殘留培養(yǎng)基，用同樣海水重新懸浮菌體，OD600控制在04。隨機(jī)抽樣12只健康青蛤，備用于制備轉(zhuǎn)錄組測序樣品。然后，采用隨機(jī)分組的方式分成鰻弧菌刺激組和藤黃微球菌刺激組。在閉殼肌內(nèi)分別注射等量的菌懸液，分別在注射后6和12 h后取青蛤血淋巴。血淋巴在4 ℃條件下，8 000 r/min離心10 min收集血細(xì)胞，加入1 mL Trizol，置于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建。

采用Trizol法提取青蛤血淋巴總RNA，產(chǎn)物使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits進(jìn)行分離與純化。純化后加入裂解緩沖液將mRNA打斷成短的片段，采用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。純化的雙鏈cDNA再經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、連接產(chǎn)物純化、PCR富集接頭連接DNA等步驟完成整個(gè)文庫的制備。利用Life Tech（Invitrogen）Qubit 2.0熒光計(jì)及生化分析儀（Agilent 2100高靈敏度芯片）檢測文庫質(zhì)量，檢測流程參照其說明書。經(jīng)質(zhì)量檢測合格的文庫使用Illumina MiSeq測序儀上進(jìn)行pair end雙端模式（PE250）測序。

1.2.3 原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理及拼接組裝。

測序后得到原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成序列數(shù)據(jù)（Raw data 或 Raw reads），原始測序數(shù)據(jù)中包含接頭信息、低質(zhì)量堿基和未測出的堿基，通過深度質(zhì)量控制（QC）過濾篩選，最終得到的數(shù)據(jù)即為有效數(shù)據(jù)（Clean data或Clean reads）。統(tǒng)計(jì)原始測序數(shù)據(jù)量以及經(jīng)過堿基質(zhì)量控制處理后reads平均長度、reads總數(shù)目和總數(shù)據(jù)量產(chǎn)出等信息。根據(jù)樣本經(jīng)過質(zhì)量控制分析所保留下來的測序reads數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本轉(zhuǎn)錄組拼接組裝。利用Trinity生物分析軟件將短的讀長拼接，得到組裝片段（Contig），將Contig互相拼接，最后得到具有一定長度的非冗余Unigene。

1.2.4 Unigene Pathway生物通路注釋。

KEGG是系統(tǒng)研究基因的生物代謝途徑和相關(guān)基因功能的大型數(shù)據(jù)庫，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對合并拼接的Unigene進(jìn)行Pathway生物學(xué)通路的注釋和預(yù)測。通過KEGG pathway注釋，對免疫相關(guān)基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5

差異基因的篩選及表達(dá)量分析。

將拼接序列與基因組序列比對，利用編碼RNA表達(dá)計(jì)算，這是通過統(tǒng)計(jì)方法估計(jì)的表達(dá)量，也用于后續(xù)樣本差異表達(dá)量比較分析。RNA表達(dá)量的計(jì)算采用FPKM計(jì)算度量指標(biāo)。表達(dá)量的計(jì)算有多種標(biāo)準(zhǔn)化方法，采用參考基因區(qū)域內(nèi)匹配read標(biāo)準(zhǔn)化模式（cufflink軟件）計(jì)算表達(dá)量與差異基因表達(dá)。

針對isoform（即Unigene）以及gene（即components）分別進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算。表達(dá)量用PFKM表示，并給出unigene對應(yīng)NR與Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫的最佳匹配結(jié)果作為其注釋。表達(dá)差異分析就是組間差異表達(dá)譜分析。差異分析可分別對基因（gene FPKM）和基因異構(gòu)體（isoform FPKM，即components）層面分別進(jìn)行考慮計(jì)算。差異分析采用edgeR軟件，在R軟件環(huán)境下實(shí)現(xiàn)。表達(dá)量差異倍數(shù)大于2（FPKM≥2）且FDR<10-5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 Unigene差異表達(dá)基因GO功能分析。

分別對Unigene進(jìn)行g(shù)ene以及isoform差異結(jié)果的GO富集度分析。GO功能聚類常用于對目標(biāo)組基因進(jìn)行功能注釋與分類。全部或差異mRNA/基因功能聚類（富集度）分析是采用GO注釋系統(tǒng)，功能注釋針對全部差異mRNA結(jié)果展開。富集度分析采用超幾何分布算法和并采用多重假設(shè)檢驗(yàn)校驗(yàn)超幾何分布統(tǒng)計(jì)量的P值，獲得校正后P值，即q值。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)

對青蛤被藤黃微球菌刺激的樣本（樣本T）進(jìn)行測序，共獲得12 916 040條Raw reads，去除低質(zhì)量的和載體序列等，共10 966 322條Clean reads（表1）。青蛤被鰻弧菌刺激的樣本（樣本M）測序，共獲得15 930 210條Raw reads，去除低質(zhì)量的和載體序列等，共13 389 388條Clean reads（表2）。樣本T的測序原始數(shù)據(jù)量為3.22 G，平均Q20為88.62 %，GC含量平均值為43.10%；樣本M的測序原始數(shù)據(jù)量為3.98 G，平均Q20為87.72 %，GC含量平均值為42.67%。轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量高，建庫成功。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的組裝拼接效果統(tǒng)計(jì)

M樣本轉(zhuǎn)錄組序列組裝拼接完成的總轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為148 238條，拼接完成的總基因數(shù)量為62 152條，轉(zhuǎn)錄本長度均值（average contig）約618.50 bp。T樣本轉(zhuǎn)錄組序列組裝拼接完成的總轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為137 940條，拼接完成的總基因數(shù)量為57 877條，轉(zhuǎn)錄本長度平均值（average contig）約644.32 bp。

2.3 免疫相關(guān)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)

通過KEGG pathway注釋（E值≤10-5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)），共893個(gè)基因注釋到15個(gè)免疫相關(guān)pathway，T細(xì)胞受體信號通路的免疫防御基因居多，其次是趨化因子信號通路，白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移，F(xiàn)cγR介導(dǎo)的吞噬作用及Toll樣受體信號通路中也包含大量免疫防御相關(guān)基因（表3）。經(jīng)序列同源性比較、功能基因注釋和代謝途徑分析，此次轉(zhuǎn)錄組測序中發(fā)掘青蛤免疫防御系統(tǒng)的相關(guān)抗病因子，主要有熱冷休克蛋白家族、親環(huán)素、非消化性的酶和酶抑制劑家族、抗菌肽家族、Toll樣受體家族及其下游信號因子等。

2.4 Unigene差異表達(dá)分析

由圖1可知，青蛤經(jīng)過革蘭氏陽性菌藤黃微球菌和革蘭氏陰性菌鰻弧菌的分別刺激，共得到2 605個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 091個(gè)基因樣品M中上調(diào)表達(dá)（樣品T中下調(diào)）和1 514個(gè)基因在樣品T中上調(diào)表達(dá)（樣品M中下調(diào)）。

2.5 差異表達(dá)基因Pathway功能富集分布

由圖2可知，共1 942個(gè)差異基因被注釋到KEGG并顯著富集到110個(gè)pathway。差異基因主要集中在以下通路：亨廷頓氏病、帕金森病、非酒精性脂肪性肝病、抗原加工提呈、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。差異基因被富集到110個(gè)pathway中，有11個(gè)pathway與免疫相關(guān)（該研究中有15個(gè)與免疫相關(guān)pathway被注釋到）。它們分別為造血細(xì)胞譜系、補(bǔ)體系統(tǒng)、Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性、抗原加工提呈、B細(xì)胞受體信號通路、FcεRI信號通路、FcγR-介導(dǎo)吞噬、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、趨化因子信號通路。

3 討論與結(jié)論

青蛤是具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋經(jīng)濟(jì)動物，近年來研究表明，引發(fā)青蛤養(yǎng)殖大規(guī)模病害和死亡的最主要因素是病原菌

的感染[8]。目前研究表明微球菌可以引發(fā)水產(chǎn)動物發(fā)生疾病，如變異微球菌（Micrococcus varians）是牙鲆出血病的病原菌，患病牙鲆會表現(xiàn)出上下頜出血發(fā)紅，體表彌散性出血。與水產(chǎn)動物病害相關(guān)的革蘭氏陽性菌廣泛分布并造成大面積病害，如藤黃微球菌（Micrococcus luteus）分散在水、土壤、空氣、植物和動物表面，一般會引起傷口等局部組織的感染，也可能會引起嚴(yán)重感染[9-10]。彭彬等[11]從患出血性疾病的黃鱔體內(nèi)首次分離到藤黃微球菌，這也是首次在水生動物體內(nèi)分離到病原菌藤黃微球菌。革蘭氏陽性菌生長過程中細(xì)胞會分泌外毒素，會引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，一定時(shí)間內(nèi)大量免疫活性物質(zhì)活性將在一定程度上升。鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是青蛤疾病的重要病原微生物，鰻弧菌的致病性與其自身的一些有毒物質(zhì)有關(guān)[12]，在脂多糖、胞外蛋白酶、溶血素等許多毒力因子的共同作用下，引發(fā)青蛤大規(guī)模病害甚至死亡的現(xiàn)象[13]?；【闹虏∵^程首先通過吸附宿主細(xì)胞，侵入細(xì)胞中，在體內(nèi)大量進(jìn)行增殖，發(fā)出有毒的物質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致宿主死亡[14]。筆者所在課題組前期研究表明一定濃度的鰻弧菌脅迫青蛤后，其會產(chǎn)生大量免疫相關(guān)的活性物質(zhì)，相關(guān)免疫基因的表達(dá)也會發(fā)生一定程度的上調(diào)[15-17]。

為深入探索導(dǎo)致貝類病害和死亡的主要病原細(xì)菌及動物的抗逆機(jī)制，國內(nèi)外對于貝類轉(zhuǎn)錄組的研究已有報(bào)道[18]，包括對多種經(jīng)濟(jì)貝類進(jìn)行了高通量測序，均獲得了大量的EST 序列。貝類免疫系統(tǒng)中的免疫防御相關(guān)的抗病因子，包括免疫識別信號Toll樣受體因子及其免疫信號通路以及下游的熱休克蛋白、親環(huán)素、非消化性的酶和酶抑制劑、抗菌肽等，為探索貝類免疫應(yīng)答方式、免疫識別防御系統(tǒng)及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了大量有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。該研究利用第二代高通量測序技術(shù)對青蛤的血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行建庫及注釋分析，在確保獲得的轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果良好的條件下，共篩選到893個(gè)免疫相關(guān)基因，并將其注釋到15個(gè)免疫相關(guān)的信號通路中。綜合序列同源性比較和功能基因注釋信息，發(fā)現(xiàn)青蛤多種免疫防御相關(guān)抗病基因，特別是在Toll樣受體信號通路中，MyD88樣轉(zhuǎn)接蛋白（Mal）、Trif 相關(guān)轉(zhuǎn)接分子（TRAM）、泛素連接酶（TRAF6），轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB及抑制物 IκB等免疫相關(guān)基因在此次青蛤轉(zhuǎn)錄組測序中首次被拼接和注釋到，為后續(xù)研究青蛤Toll信號通路信號傳導(dǎo)機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)[19]。

在水產(chǎn)動物的免疫研究中，采用外界病原生物刺激的方法獲得大量差異表達(dá)基因，這為后期綜合分析其免疫應(yīng)答方式和免疫防御提供數(shù)據(jù)支持。Astrofsky等[20]將白斑病毒感染后的藍(lán)蝦與健康藍(lán)蝦進(jìn)行基因表達(dá)差異比較，獲得32個(gè)差異表達(dá)基因，其中某些差異表達(dá)基因與提高藍(lán)蝦抗病能力密切相關(guān)，該研究為選育抗病品種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。Huvet等[21]利用亮弧菌分別刺激抗性牡礪和易感性牡礪，通過基因表達(dá)的比較分析，共獲得150個(gè)差異表達(dá)基因，經(jīng)分析抗性牡礪和易感性牡礪存在免疫防御功能方面存在差異。該研究利用革蘭氏陽性菌和陰性菌刺激青蛤后，從構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫中拼接獲得了2 605個(gè)差異表達(dá)基因。在上述差異表達(dá)基因中，有1 091個(gè)基因在樣品M中上調(diào)表達(dá)（相對于樣品T），而1 514個(gè)基因在樣品T中上調(diào)表達(dá)（相對于樣品M）。此外，通過對差異基因Pathway功能富集，其中共有1 942個(gè)差異基因顯著富集到110個(gè)通路中，其中有11個(gè)pathway跟免疫相關(guān)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明青蛤?yàn)閼?yīng)答不同病原物的入侵，不同免疫因子參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，而特定基因的差異性表達(dá)證明其對于革蘭氏陽性菌和陰性菌的識別和清除作用有一定的差異。綜上所述，該研究結(jié)果為后期研究青蛤的先天性免疫的應(yīng)答機(jī)制以及病害防治提供新途徑。

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