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    甘草硒糖蛋白的制備工藝及對DPPH的清除作用研究

    2018-05-14 08:59廉亞楠趙勝男李國清2,彭李建惠高金波
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年27期
    關(guān)鍵詞:糖蛋白甘草

    廉亞楠 趙勝男 李國清 2,彭 翔 李建惠 高金波

    摘要 [目的]考察甘草硒糖蛋白的制備工藝,探究其對DPPH自由基的清除作用。[方法]在硝酸催化劑的作用下加入亞硒酸鈉,使甘草糖蛋白與亞硒酸鈉作用,生成甘草硒糖蛋白,用HPLC法檢測硒含量,以產(chǎn)率和硒含量為指標(biāo),確定其合成的最佳工藝。采用分光光度法測定甘草硒糖蛋白、甘草糖蛋白和Vc對DPPH自由基的清除能力。[結(jié)果]甘草硒糖蛋白的最佳制備工藝條件:甘草糖蛋白與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1∶1,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間為8 h,BaCl2的量為1.0 g。在此條件下制備的甘草硒糖蛋白,硒含量平均為4.78 mg/g,平均產(chǎn)率為75.62 %。對DPPH自由基的清除能力的試驗結(jié)果:甘草糖蛋白、甘草硒糖蛋白和Vc的IC50值分別為1.789、1.410和0.427 mg/mL。[結(jié)論]該制備方法簡單易行,安全,污染較小,硒含量較高;且甘草硒糖蛋白清除DPPH自由基能力強(qiáng)于甘草糖蛋白。

    關(guān)鍵詞 甘草;糖蛋白;硒化;DPPH

    中圖分類號 S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2018)27-0017-04

    Selenization and Scavenging Activity to DPPH of Licorice Glycoprotein

    LIAN Yanan1,ZHAO Shengnan1,LI Guoqing2 et al

    (1.Jiamusi University,Jiamusi,Heilongjiang 154007;2.Harbin University,Harbin,Heilongjiang 150000)

    Abstract [Objective]The selenization process of glycyrrhiza glycoprotein was investigated and its scavenging effect to DPPH free radical was explored. [Method]Under the action of nitric acid catalyst, adding sodium selenite performed licorice glycoprotein structure modification, generated selenide licorice glycoprotein. Selenium content of organic selenium compounds was detected by HPLC to determine the optimum process, yield and selenium content for indicators. Spectrophotometry was used to determine DPPH free radical scavenging activity of licorice selenium glycoprotein, licorice glycoprotein and Vc. [Result] The optimum process for selenide licorice glycoprotein was reaction temperature of 70℃ and time of 8 hours, the mass ratio of icorice glycoprotein to sodium selenite 1∶1, amount of BaCl2 1.0 g. Under these conditions, the average selenium content was 4.78mg / g, and average extraction rate was 75.62%. Scavenging activity of licorice selenium glycoprotein, licorice glycoprotein and Vc to DPPH radical scavenging ability respectively were 1.789 mg/mL,1.410 mg/mL and 0.427 mg/mL. [Conclusion] Process of glycoprotein selenium was simple, and easy to control, it also polluted less,content of selenium was high. Licorice selenium glycoprotein scavenging DPPH free radicals was stronger than licorice glycoprotein.

    Key words Licorice;Glycoproteins;Selenization;DPPH

    基金項目 黑龍江省中醫(yī)藥科研項目 (ZHY16-115)。

    作者簡介 廉亞楠(1993—),女,河南焦作人,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物藥物分析。*通訊作者,教授,從事天然產(chǎn)物藥物分析研究。

    收稿日期 2018-05-22;修回日期 2018-05-28

    甘草(liquorice root),為多年生草本,其根以及根狀莖很粗壯,具有多種藥理活性[1]。糖蛋白(glycoprotein)是由寡糖和蛋白質(zhì)以多肽鏈共價修飾連接而形成的一類重要生理活性物質(zhì),它廣泛存在于植物、動物體內(nèi)[2]。近年來,從植物中分離的糖蛋白日益增多,由于糖蛋白具有種屬專一性,決定了不同植物的糖蛋白具有不同特性[3]。糖蛋白的活性受到其分子結(jié)構(gòu)的影響很大,對糖蛋白分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾,引入某些化學(xué)基團(tuán),如乙?;?、羧甲基、磷酸根等,不僅使糖蛋白的結(jié)構(gòu),理化性質(zhì)發(fā)生變化,還在一定程度上改變了生物活性[4],對于糖蛋白構(gòu)效方面的研究,這種化學(xué)修飾具有重要的意義。硒是人體必須的微量元素,對40多種危害人類生命和健康的疾病,如克山病大骨節(jié)病[5]、糖尿病、心臟病、癌癥[6-8]等,都有良好的療效。無機(jī)硒是有毒的硒,經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化變成有機(jī)硒,毒性降低[9-10]。為降低無機(jī)硒化物的毒性,以甘草糖蛋白為原料,在一定條件下使其與亞硒酸鈉結(jié)合,制備出甘草硒糖蛋白(UGC-Se),在制備過程中,先采用單因素方法考察溫度、催化劑、反應(yīng)時間、原料配比等因素對制備UGC-Se產(chǎn)率和硒含量的影響,然后進(jìn)行正交設(shè)計和正交試驗;在此基礎(chǔ)上,考察UGC-Se對DPPH自由基的清除作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑和儀器

    試驗材料:甘草糖蛋白,用超臨界CO2輔助水提醇沉法優(yōu)化條件提取,又經(jīng)DEAE-52和SephadexG-75分離純化得到。試劑:亞硒酸鈉(分析純,上海新寶精細(xì)化工),鄰苯二胺(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),抗壞血酸(分析純,天津市凱通化學(xué)試劑有限公司),濃硫酸(分析純,北京化工廠),氯化鋇(分析純,北京化工廠)。試驗儀器:UV757CRT型紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司),AgiLent 1100型高效液相色譜儀(AgiLent公司),分析天平(FA2004型,上海恒平科學(xué)儀器有限公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 硒含量的檢測。

    1.2.1.1 色譜條件。

    色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18(520 mm×4.6 mm);流動相為甲醇∶水=45∶55;檢測波長為330 nm;流速1.0 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量10 μL。

    1.2.1.2 樣品的處理方法。

    準(zhǔn)確稱取50 mg甘草硒糖蛋白放入試管中,加入消解液1 mL[濃硝酸∶濃硫酸=1∶1(V/V)]冷消化過夜,100 ℃水浴加熱6 h。當(dāng)黃褐色氣體全部排盡后,冷卻至室溫,加入6 mol/L HCl溶液2.5 mL,沸水浴加熱至溶液呈無色或淡黃色,冷卻,定容至10 mL容量瓶。

    1.2.1.3 檢測方法。

    取pH 2.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液3.0 mL置于試管中,取消解后的溶液1.0 mL,加入1.0 mg/mL鄰苯二胺溶液1.0 mL,在40 ℃反應(yīng)100 min后取出冷卻至室溫,加磷酸氫二鈉溶液調(diào)pH至中性,然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶,定容,過濾,10 μL進(jìn)樣,讀取色譜峰面積。

    1.2.1.4 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

    準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的亞硒酸鈉放入試管中,按“1.2.1.2”進(jìn)行處理,處理后配制成終濃度分別為0.2、0.6、2.0、6.0、10.0、30.0、50.0 μg/mL的亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,再按檢測方法進(jìn)行操作,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.2 UGC-Se的制備工藝。

    稱取一定質(zhì)量的甘草糖蛋白置于三頸瓶中,加2%醋酸溶液50 mL,加熱攪拌使其溶解,加入一定比例的Na2SeO4,加入一定質(zhì)量的BaCl2作為催化劑,反應(yīng)2 h后,逐滴加入10%硝酸2 mL,在一定溫度下反應(yīng)一段時間,冷卻至室溫。滴加1 mol/L硫酸至無新沉淀產(chǎn)生為止,離心,除去催化劑,用無水Na2CO3調(diào)節(jié)pH至5~6,流水透析36 h以上,除去游離Se元素,80%以上醇沉靜止過夜,離心,干燥,得UGC-Se,稱重,計算產(chǎn)率,檢測硒含量。

    1.2.3 制備工藝的單因素試驗。

    1.2.3.1 原料配料比。

    按“1.2.2”方法,甘草糖蛋白與Na2SeO4的質(zhì)量比分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1;加入BaCl2的量為0.5 g,反應(yīng)時間為8 h,反應(yīng)溫度為70 ℃,進(jìn)行制備。

    1.2.3.2 反應(yīng)溫度。

    按“1.2.2”方法,甘草糖蛋白與Na2SeO4的質(zhì)量比為1∶1,BaCl2的量為0.5 g,反應(yīng)時間為8 h,其反應(yīng)溫度分別為50、60、70、80、90 ℃,進(jìn)行制備。

    1.2.3.3 反應(yīng)時間。

    按“1.2.2”方法,甘草糖蛋白與Na2SeO4的質(zhì)量比為1∶1,BaCl2的質(zhì)量為0.5 g,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間分別為6、7、8、9、10 h,進(jìn)行制備。

    1.2.3.4 BaCl2用量。

    按“1.2.2”方法,甘草糖蛋白與Na2SeO4的質(zhì)量比為1∶1,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間為8 h,BaCl2的用量分別為0.25、0.50、1.00、1.25、1.50 g進(jìn)行制備。

    1.2.3.5 正交試驗。

    選擇配料比(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時間(C)、BaCl2用量(D)為考察因素,按L9(34)正交設(shè)計制備UGC-Se(表1)。

    1.2.4 UGC-Se紅外光譜測定。

    用FTIR-8900紅外光譜儀,采用KBr壓片,測定甘草糖蛋白和甘草硒糖蛋白的紅外光譜圖。

    1.2.5 UGC-Se對DPPH自由基的清除作用。

    取10 mL試管,依次加入2 mL不同濃度(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL)的樣品溶液,再分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液,均勻混合,在37 ℃恒溫水浴鍋中加熱,注意避光,30 min后,在517 nm處,測定吸光度As;取相應(yīng)濃度的樣品液2 mL,加入2 mL無水乙醇,在37 ℃恒溫水浴鍋中加熱,避光,30 min后,在517 nm處,測吸光度Ax;取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,加入2 mL蒸餾水,在37 ℃水浴鍋中加熱,避光,30 min后,在517 nm處,測吸光度A0。以Vc為陽性對照。按如下公式計算樣品對DPPH的清除率,并計算其IC50值。

    DPPH清除率=A0-(As-Ax)A0×100%

    2 結(jié)果與分析

    2.1 硒含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    根據(jù)硒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=11877x+24.09,相關(guān)系數(shù)為r =0.999 2,在0.2~50.0 μg/mL線性范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,可以用于硒含量的測定。

    2.2 制備工藝單因素試驗結(jié)果

    2.2.1 物料比對UGC-Se產(chǎn)率及硒含量的影響。

    如圖1所示,甘草糖蛋白和亞硒酸鈉的質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1時,硒含量及產(chǎn)率逐漸增大,當(dāng)1∶1時,硒含量及產(chǎn)率達(dá)到最高;而后,隨著亞硒酸鈉質(zhì)量的增加,硒含量及產(chǎn)率反而降低,說明甘草糖蛋白與亞硒酸鈉之間的反應(yīng)存在相互依存的關(guān)系。

    2.2.2 反應(yīng)溫度對UGC-Se產(chǎn)率及其硒含量的影響。

    如圖2所示,溫度增加反應(yīng)速度加快,在60~90 ℃的范圍內(nèi),UGC-Se的硒含量隨溫度的升高而降低;其產(chǎn)率隨溫度的升高先增加,70 ℃時,達(dá)到最大,溫度再升高對產(chǎn)率的影響較??;綜合考慮以70 ℃為宜。

    2.2.3 反應(yīng)時間對UGC-Se產(chǎn)率及其硒含量的影響。

    如圖3所示,UGC-Se產(chǎn)率和硒含量,均隨著時間的增長呈現(xiàn)先增大后降低趨勢;反應(yīng)7 h時,產(chǎn)率達(dá)到最大;反應(yīng)時間為8 h時,硒含量達(dá)到最大。

    2.2.4 BaCl2用量對UGC-Se產(chǎn)率及其硒含量的影響。

    2.3 正交試驗優(yōu)化反應(yīng)因素結(jié)果

    根據(jù)正交設(shè)計進(jìn)行正交試驗的結(jié)果列于表2,方差分析結(jié)果列于表3。

    由表2可知,影響UGC-Se產(chǎn)率的4個因素大小為:B>A>D>C,說明反應(yīng)溫度對產(chǎn)率的影響最大,其次是配料比,最佳工藝條件是A2B2C2D3。而影響UGC-Se硒含量的4個因素由大到小為A>C>D>B,即甘草糖蛋白和亞硒酸鈉的質(zhì)量比是影響硒含量的主要因素,其次是反應(yīng)時間,最佳工藝條件是A2B3C2D2。由于在兩者的最佳工藝中,只有B和D不同,而兩者都不是最主要的影響因素,綜合兩者的影響效應(yīng)得最佳制備工藝條件為A2B2C2D3。

    2.4 工藝條件驗證試驗結(jié)果

    根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果,在配料比為1∶1,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間為8 h,BaCl2量為1.0 g的優(yōu)化條件下,制備3批UGC-Se,平均硒含量為4.78 mg/g,平均提取率為75.62%,表明此條件下制備的UGC-Se的產(chǎn)率及硒含量均較高。

    2.5 甘草硒糖蛋白的紅外光譜法表征

    如圖5所示,硒化反應(yīng)前后,甘草糖蛋白的紅外光譜發(fā)生變化。對圖5 進(jìn)行解析,3 444、2 927、1 625、1 429和1 018 cm-1附近的吸收峰為多糖和蛋白質(zhì)的特征吸收峰,而3 444 cm-1左右吸收峰為 O—H的伸縮振動,是由于分子內(nèi)氫鍵的形成,使峰變寬,2 927 cm-1處的吸收峰較弱,是C—H伸縮振動,以上2處吸收峰為多糖的特征峰;1 625 cm-1處為CO的伸縮振動和N—H的變角振動,1 429 cm-1是C—H的變角振動引起的,以上2處為蛋白質(zhì)的特征吸收峰;在1 000~1 200 cm-1處的C—O鍵的吸收峰,說明糖蛋白中含吡喃環(huán)。在1 751 cm-1處多出的峰為SeO的特征峰,1 253和410 cm-1處的峰增強(qiáng),說明含有Se—C的存在,1 330 cm-1處多出峰為Se—O—C特征吸收峰,證明成功制備了UGC-Se。

    2.6 DPPH清除結(jié)果

    不同濃度的UGC-Se清除DPPH的結(jié)果見圖6。

    結(jié)果表明,在1.0~1.8 mg/mL的濃度范圍內(nèi),甘草糖蛋白和甘草硒糖蛋白的最高清除率分別為50.55 % 和70.65 %,Vc在0.2~1.0 mg/mL時,最高清除率為93.98 %,其IC50值分別為1.789、1.410和0.427 mg/mL。

    3 結(jié)論

    通過單因素試驗和正交試驗對制備過程進(jìn)行優(yōu)化,得到甘草硒糖蛋白的最佳制備條件為甘草糖蛋白與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1∶1,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間為8 h,BaCl2的量為1.0 g,用乙醇進(jìn)行醇沉,在此條件下制備的甘草硒糖蛋白,測得其平均硒含量為4.78 mg/g,平均產(chǎn)率為75.62%。研究表明,該試驗的制備方法具有儀器簡單、反應(yīng)條件容易控制、反應(yīng)效果好、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點。在1.0~1.8 mg/mL時,UGC-Se對DPPH自由基的最高清除率為70.65%,其IC50值為1.410 mg/mL,表明具有一定的抗氧化能力,可為甘草糖蛋白的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

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