異葉茴芹總黃酮的三種提取方法的比較

蘇華香 王張英 王志新

[摘要] 比較提取異葉茴芹總黃酮的三種方法：超聲輔助提取法、微波輔助提取法、乙醇浸泡提取法的總黃酮提取率，針對(duì)超聲輔助提取異葉茴芹總黃酮方法，進(jìn)一步探究其最佳提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異葉茴芹總黃酮提取率為：超聲波輔助提取>微波輔助提取>乙醇浸泡提取。通過正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取進(jìn)行優(yōu)化，得到超聲波輔助提取法最佳提取條件為：料液比1：30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波處理40min。在此提取條件下，異葉茴芹總黃酮的提取率達(dá)到16.98%。

[關(guān)鍵詞] 異葉茴芹；總黃酮；提?。徽辉囼?yàn)

[中圖分類號(hào)]S567.239 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

異葉茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）又名山當(dāng)歸、苦爹菜、蛇倒退，是傘形科茴芹屬多年生草本植物。異葉茴芹是常用民間草藥，可用于活血散淤、解毒消腫，在民間是藥食兼用的野菜。異葉茴芹含有黃酮類化合物等多種有效成分。研究表明，黃酮類化合物藥用價(jià)值豐富，作用廣泛且臨床研究表明無明顯毒副反應(yīng)，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，具有抗氧化、抗炎、抗菌及提高免疫功能的作用。近年來，對(duì)不同植物中總黃酮的提取研究多有報(bào)道，但少見對(duì)異葉茴芹總黃酮提取方法及提取工藝研究。

本研究通過比較3種提取方法提取異葉茴芹總黃酮的提取率，選出最佳提取方法，進(jìn)一步設(shè)計(jì)單因素正交試驗(yàn)，優(yōu)化出提取異葉茴芹總黃酮的最佳提取條件，為今后異葉茴芹總黃酮資源的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；SB-5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；EG823LC9-NRH美的微波爐（廣東美的微波電器制造有限公司）；KC-100高速粉碎機(jī)（北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司）；722SP14116可見光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；DHG-9040A電熱恒溫鼓風(fēng)干箱（寧波江南儀器廠）；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料購于福建省寧德市，經(jīng)衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院王志新講師鑒定，確為異葉茴芹植株。異葉茴芹干燥粉碎后過60目篩，以無水乙醚為有機(jī)溶劑，60℃水浴，冷凝回流脫葉綠素，存放在干燥避光處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20130528）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醚、均為分析純、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、蒸餾水。

2 方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品13mg，用60%乙醇溶液溶解（水浴加熱），冷卻至室溫，定容至100 mL的容量瓶中，搖勻，則配制得到濃度為130μg·mL-1的蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL，分別置于6支10mL容量瓶中，依次加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液5.0mL，4.0mL，3.0mL，2.0mL，1.0mL，0 mL，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，分別加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，各加入4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻，最后用60%乙醇溶液定容。靜置10min后于510nm處測量吸光度A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得直線回歸方程為：Y=0.0112X-0.004，X為質(zhì)量濃度（μg·mL-1），Y為吸光度，R?=0.9998。

2.2 樣品溶液的制備

精密稱取異葉茴芹粉末0.5g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用保鮮膜密封，分別置于超聲波清洗器，微波爐，常溫浸泡提取，離心，收集上清液，放置待測。

2.3 總黃酮含量測定

精密吸取上述各提取溶液0.05mL，置于10mL容量瓶中，依次加入60%乙醇溶液5.0mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置5min后，加入4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻，最后用60%乙醇溶液定容。靜置10min后于510nm處測量吸光度，每種提取液平行測定3次，根據(jù)蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各提取液中總黃酮濃度（μg·mL-1），取平均值。

總黃酮的提取率=×10-6×100%

C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的總黃酮的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V為乙醇體積（mL）；M為稱取異葉茴芹的質(zhì)量（g）。

3 結(jié)果與分析

3.1 三種提取方法比較

精密稱取異葉茴芹粉末0.5g，加入15mL60%乙醇溶液至50mL錐形瓶，用保鮮膜密封，分別置于超聲波清洗器中室溫超聲提取10min，微波爐中加熱3min，常溫浸泡提取4h，4000r·min-1離心10min，收集上清液，按照2.3項(xiàng)方法計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果表明超聲波輔助提取、微波輔助提取、乙醇浸泡提取所得總黃酮提取率依次降低，分別為15.53%，15.43%和12.70%。實(shí)驗(yàn)可知，超聲波輔助提取法效果最佳，因此，選取超聲波輔助提取異葉茴芹總黃酮。

3.2 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

3.2.1 料液比對(duì)異葉茴芹總黃酮提取率的影響 精密稱取0.5g異葉茴芹粉末于50mL錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液5mL，10mL，15mL，20mL，25mL，用保鮮膜密封，置超聲波清洗器中室溫超聲提取10min，4000r·min-1離心10min，收集上清液，用分光光度法測定吸光度，按照2.3項(xiàng)方法計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見表1。在料液比從1：10到1：20范圍內(nèi)，總黃酮提取率升高，異葉茴芹總黃酮充分溶于乙醇中。在料液比為1：20到1：50處，提取率逐漸減低?？赡苁且?yàn)殡S著料液比增大，總黃酮提取液濃度降低，異葉茴芹中其他成分溶于乙醇，使總黃酮濃度相對(duì)降低?？梢娏弦罕?：20是異葉茴芹總黃酮提取的最佳料液比。

3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)異葉茴芹總黃酮提取率的影響 精密稱取0.5g異葉茴芹粉末于50mL錐形瓶中，分別體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%的乙醇溶液10mL。用保鮮膜密封，置超聲波清洗器中室溫超聲提取10min，4000r·min-1離心10min，收集上清液，用分光光度法測定吸光度，按照2.3項(xiàng)方法計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見表2。乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)低于60%時(shí)，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而提高，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，總黃酮提取率降低，在60%乙醇處有最佳提取率。總黃酮的溶解與有機(jī)溶劑性質(zhì)相似性有關(guān)，相似性越大，溶解率越高，所得總黃酮提速率越大。乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，一些醇溶性物質(zhì)競爭性與乙醇結(jié)合，降低了提取液中總黃酮的含量，提取率減小。

3.2.3 提取時(shí)間對(duì)異葉茴芹總黃酮提取率的影響 精密稱取0.5g異葉茴芹粉末于50mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液10 mL，用保鮮膜密封，分別置超聲波清洗器中處理10min，20min，30min，40min，50min，4000r·min-1離心10min，收集上清液，用分光光度法測定吸光度，按照2.3項(xiàng)方法計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見表3。超聲波輔助提取異葉茴芹總黃酮40min是最佳的提取時(shí)間。超聲波處理時(shí)間在10～40min以內(nèi)，處理時(shí)間越長，乙醇和異葉茴芹粉末接觸更加充分，提取的黃酮量越大，提取率也越高。繼續(xù)延長浸泡時(shí)間至50min時(shí)，提取率反而比40 min時(shí)的提取率小。由于長時(shí)間震蕩，使一些不穩(wěn)定的黃酮類物質(zhì)開始分解，提取液中的黃酮類化合物含量降低，提取率減小。

3.3 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照L9（33）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表5，表6。

由表5可知，極差RA>RC>RB，即超聲波輔助提取影響總黃酮提取率的大小為：料液比>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。直觀分析超聲波輔助提取最佳提取工藝組合為A3B2C2。由表6可知，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取時(shí)間都對(duì)總黃酮提取率具有極顯著影響，其中料液比對(duì)總黃酮提取率影響最大，三個(gè)實(shí)驗(yàn)因素之間相互作用顯著。因最佳提取工藝組合不在正交表，設(shè)計(jì)試驗(yàn)提取條件為料液比1：30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波處理40min，提取率為16.98%，驗(yàn)證A3B2C2為最佳提取工藝。

4 討論

黃酮類化合物具有多種生物活性，現(xiàn)已有諸多利用不同植物提取總黃酮的研究，是國內(nèi)外天然藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以乙醇為提取劑從異葉茴芹全草提取總黃酮，對(duì)超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、乙醇浸泡提取三種方法提取效果進(jìn)行比較，并進(jìn)一步對(duì)超聲波輔助提取工藝進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明總黃酮提取率為：超聲波輔助提取>微波輔助提取>乙醇浸泡提取。異葉茴芹總黃酮含量較高，三種方法提取率均高于12%，與乙醇浸泡提取相比，超聲波輔助提取法和微波輔助提取法能縮短提取時(shí)間，所得異葉茴芹中總黃酮提取率高。微波輔助提取法處理時(shí)間比超聲波輔助提取法更短，但難以操作，如：微波處理時(shí)因溫度高，提取液易揮發(fā)或噴瓶。超聲波輔助提取法易于操作，且提取率高，最適合用于提取異葉茴芹總黃酮。采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出超聲波輔助提取法最佳提取條件為料液比為1：30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波處理40min，提取率達(dá)16.98%。本研究為今后提取異葉茴芹總黃酮提供了一定的數(shù)據(jù)參考。

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