細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶（綜述）

嚴(yán)鴻林

摘 要：纖維素是地球上一種豐富的天然生物聚合物和主要的農(nóng)業(yè)廢棄物。這種纖維素生物質(zhì)是一種具有被生物轉(zhuǎn)化為增值生物產(chǎn)品巨大潛力的豐富的可再生資源。它可以被纖維素分解菌產(chǎn)生的纖維素酶降解。這種酶有多種工業(yè)用途，目前被認(rèn)為是最重要的工業(yè)酶。本綜述將探討纖維素酶的應(yīng)用、分類和定量以及纖維素分解菌的類型和篩選，也將介紹通過(guò)液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)纖維素酶、纖維素酶的性質(zhì)以及纖維素酶基因的克隆和表達(dá)的最新知識(shí)。此外，本文還將討論研究纖維素酶的生物技術(shù)及其未來(lái)展望。

關(guān)鍵詞：纖維素分解菌；生物轉(zhuǎn)化；纖維素酶；內(nèi)切葡聚糖酶；外切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶；纖維小體

中圖分類號(hào)：S8516 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2018）09-0051-04

地球每年大約產(chǎn)生2 000億t CO2，這意味著有相同數(shù)量的有機(jī)物被降解，其中30%被動(dòng)植物利用而其他的70%被微生物降解。一般來(lái)說(shuō)，纖維素約占植物生物質(zhì)干重的50%。這些植物生物質(zhì)是可供人類使用的燃料和材料的唯一可預(yù)見(jiàn)的可持續(xù)來(lái)源。農(nóng)業(yè)廢棄物是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的主要來(lái)源，木質(zhì)纖維素具有可再生、未開(kāi)發(fā)且廉價(jià)的特點(diǎn)。這些可再生資源來(lái)自玉米皮、玉米秸稈、甘蔗渣、稻草、稻殼、木本作物、森林殘留物的葉子、莖和秸稈。除此之外，它們還來(lái)自工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素廢棄物，如柑橘皮、椰子生物質(zhì)、木屑、紙漿、工業(yè)廢料、城市纖維固體廢物和造紙廠污泥。此外，它們還可來(lái)自生物燃料專用能源作物，包括多年生牧草（如柳枝稷）和其他牧草飼料（如芒草、大象草、百慕達(dá)草等）。

大約70%的植物生物質(zhì)被鎖定在5-碳糖和6-碳糖中。這些糖存在于木質(zhì)纖維生物質(zhì)中，木質(zhì)纖維生物質(zhì)主要由可被一種復(fù)雜的酶系統(tǒng)即纖維素酶（外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等）水解的木質(zhì)素（由β-1，4糖苷鍵鏈接的葡萄糖同源聚合物）、少量的半纖維素（由戊糖D-木糖、達(dá)拉定糖和己糖D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖與糖酸組成的5-和6-碳糖的異源聚合物）和極少量的木質(zhì)素（一種復(fù)雜的芳香族聚合物）組成。在硬木中，半纖維素主要為木聚糖；而在軟木中，半纖維素主要是葡甘露聚糖。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，木聚糖降解需要內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶。葡甘露聚糖的降解需要β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶切割其聚合物骨架。

有限的天然化石燃料儲(chǔ)備正在以驚人的速度被文明世界消耗。燃燒化石燃料也引起了對(duì)不穩(wěn)定且不確定石油資源、燃料成本上漲以及全球氣候變暖的擔(dān)憂。這些擔(dān)憂已經(jīng)轉(zhuǎn)向到利用可再生資源來(lái)生產(chǎn)能夠滿足世界高能需求的“更加綠色的”能源替代品。到2010年，加拿大可再生能源燃料標(biāo)準(zhǔn)提高到乙醇含量5%的混合燃料；2009年美國(guó)環(huán)保局將其可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)提高到乙醇含量10.21%的混合燃料；而巴西的混合燃料的標(biāo)準(zhǔn)是含25%的乙醇（2007年確立）。纖維素酶占全球工業(yè)酶需求量的8%。當(dāng)纖維素酶用于將預(yù)處理的纖維素類物質(zhì)水解成糖（所產(chǎn)糖可以大規(guī)模發(fā)酵成生物乙醇和生物堿產(chǎn)品）時(shí)，纖維素酶市場(chǎng)將大幅擴(kuò)張。據(jù)估計(jì)，美國(guó)的纖維素酶市場(chǎng)每年高達(dá)4億美元。在2004-2014年期間，作為一種特殊的酶，纖維素酶的使用量預(yù)計(jì)將增加一倍。生物技術(shù)公司Genencor國(guó)際公司和Novozymes公司報(bào)道，他們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可以降低纖維素至乙醇轉(zhuǎn)化工藝中所用纖維素酶成本的技術(shù)，使每加侖乙醇的生產(chǎn)成本從5.4美元降低至20美分左右，其中兩個(gè)重要策略是：（1）控制纖維素酶的生產(chǎn)成本，通過(guò)優(yōu)化加工工藝和增強(qiáng)菌株產(chǎn)酶能力來(lái)降低每千克酶的生產(chǎn)成本，例如：從乳糖到葡萄糖選用更廉價(jià)的培養(yǎng)基和新的誘導(dǎo)系統(tǒng)； （2）提高纖維素酶的性能以在減少酶使用量的同時(shí)能獲得與酶混合物相同的水解能力，同時(shí)改善酶產(chǎn)品的組成。

除此之外，纖維素酶在工業(yè)上的主要應(yīng)用是紡織工業(yè)中織物的生物拋光和生產(chǎn)砂洗外觀的牛仔布以及用于增加衣物柔軟度和亮度的家用洗滌劑。另外，它們還應(yīng)用于動(dòng)物飼料中以提高養(yǎng)分消化率和質(zhì)量，以及用來(lái)制作果汁和烘焙食品，而紙張脫墨是另一個(gè)新興的用途。纖維素酶有可能發(fā)揮重要作用的一個(gè)挑戰(zhàn)性領(lǐng)域是將可再生的纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為商用化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化。酶在清潔劑、皮革和造紙工業(yè)中的應(yīng)用需要能夠在極端pH和溫度條件下具有高穩(wěn)定活性。纖維素酶和纖維素分解菌的一些重要用途列于表1中。

本篇綜述將闡述在自然以及人工技術(shù)條件下纖維素酶的生產(chǎn)。此外，本文將從綜合視角以及纖維素分解菌和酶系統(tǒng)多樣性的角度描述細(xì)菌性纖維素酶的應(yīng)用，并將力圖討論纖維素酶在細(xì)菌系統(tǒng)中的作用方式和它們的分子生物調(diào)節(jié)作用。此外，本文還將探討異源宿主中纖維素酶基因的克隆和表達(dá)、以及這些罕見(jiàn)的纖維素酶如何幫助人們解決生物燃料工業(yè)的一些重要技術(shù)瓶頸和生物技術(shù)中一些獨(dú)特的細(xì)菌策略如何幫助生物煉制。

1 纖維素酶的分類

微生物產(chǎn)生的纖維素酶以游離或與細(xì)胞結(jié)合的方式水解和代謝不可溶性纖維素。在過(guò)去30年中，人們已經(jīng)對(duì)需氧、厭氧細(xì)菌及真菌產(chǎn)生的纖維素酶系統(tǒng)的生物化學(xué)分析技術(shù)進(jìn)行了全面的綜述。以下的纖維素酶系統(tǒng)是根據(jù)其催化作用模式進(jìn)行分類的（表2）。

1.1 內(nèi)切葡聚糖酶或內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.4）

內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素多糖鏈中的內(nèi)部無(wú)定形位點(diǎn)隨機(jī)切割，產(chǎn)生各種長(zhǎng)度的寡糖以及新的鏈末端。它通常作用于酸膨脹的無(wú)定形纖維素、纖維素的可溶性衍生物如羧甲基纖維素和纖維低聚糖等底物。

1.2 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶（纖維二糖水解酶）（EC 3.2.1.91）

外切葡聚糖酶以強(qiáng)占的方式作用于纖維素多糖鏈的還原性或非還原性末端，產(chǎn)生兩個(gè)重要的產(chǎn)物葡萄糖（葡萄糖水解酶）和纖維二糖（纖維二糖水解酶）。這些酶對(duì)結(jié)晶底物如微晶纖維素、無(wú)定形纖維素和纖維寡糖具有活性。然而，它們對(duì)纖維二糖或可溶性纖維素衍生物如羧甲基纖維素?zé)o活性。

1.3 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶（也稱為纖維糊精酶）（EC 3.2.1.74）

它能夠催化除去纖維寡糖或硝基苯基-β-纖維二糖苷中的纖維二糖，但對(duì)無(wú)定形纖維素或羧甲基纖維素?zé)o活性。

1.4 β-葡糖苷酶或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶（EC 3.2.1.21）

β-葡糖苷酶可從非還原端將可溶性纖維糊精和纖維二糖水解成葡萄糖。它對(duì)結(jié)晶或無(wú)定形纖維素?zé)o活性。

1.5 纖維二糖磷酸化酶或纖維二糖：正磷酸α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.20）

它能夠催化纖維二糖的可逆磷酸裂解部。該酶最初由Ayers等在紅球菌（Ruminococcus albus）的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。

纖維二糖 + H3PO4 = α-D-葡萄糖 1-磷酸 + 葡萄糖

1.6 纖維糊精磷酸化酶或1，4-β-D-寡葡聚糖正磷酸鹽α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.49）

它在熱感染梭菌細(xì)胞中被人們發(fā)現(xiàn)，對(duì)纖維二糖不起作用，但可催化纖維糊精從纖維三糖到纖維六糖的可逆磷酸化裂解。

（1，4-β-D-葡糖基）n + H3PO4 = （1，4-β-D-葡糖基）n-1 +α-D-葡萄糖-1-磷酸

1.7 纖維二糖差向異構(gòu)酶（EC 5.1.3.11）

它最初在紅球菌的細(xì)胞中被人們發(fā)現(xiàn)，催化下列反應(yīng)：

纖維二糖 = 4-O-β-D-葡萄糖基甘露糖

2 篩選產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌

通常在含有結(jié)晶纖維素或微晶纖維素（如微晶纖維素）[瓊脂中的最終濃度為0.1%～0.5%（w/v）]的平板上篩選有細(xì)菌性纖維素酶活性的微生物分離株。在經(jīng)過(guò)一段合適時(shí)期的孵育后，若菌落周圍出現(xiàn)一個(gè)清除的區(qū)域，表明這是纖維素生產(chǎn)者。然而，能分解纖維素的噬細(xì)胞菌屬細(xì)菌不會(huì)出現(xiàn)任何的清除區(qū)域。因此清除區(qū)域的直徑可能無(wú)法精確反映此細(xì)菌真實(shí)的纖維素酶活性。

為快速篩選可以產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌，在用含0.5%（w/v）的羧甲基纖維素為唯一碳源的瓊脂培養(yǎng)基孵育后，用1%（w/v）剛果紅浸泡；20 min后倒出該染料，該平板再用 5 M的NaCl溶液浸泡，20 min～30 min后倒出NaCl溶液。在紅色背景上，被一個(gè)淺橙色至透明的區(qū)域包圍的菌落即是可產(chǎn)生纖維素酶的陽(yáng)性細(xì)菌。此纖維素分解菌可用此類平板直接篩選出，但要分離出活性菌落，利用總平板的復(fù)制平板培養(yǎng)法更適合，因?yàn)榻莸脑噭?huì)傷害分離株。Plant等報(bào)道了將天青色纖維素加入瓊脂管上面兩層來(lái)分析細(xì)菌的纖維素酶活性的半定量測(cè)定法。底物中釋放的染料可以用光密度法測(cè)定。Kasana等（2008）發(fā)現(xiàn)，用革蘭氏碘替代十六烷基三甲基溴化銨或剛果紅染色平板，能快速得到高辨識(shí)度的結(jié)果。

然而，利用染料進(jìn)行的平板篩選法并不是一種定量方法，因?yàn)槊富钚耘c光暈大小之間的相關(guān)性較差。這個(gè)問(wèn)題可通過(guò)開(kāi)發(fā)一類含有經(jīng)過(guò)修飾的還原末端和發(fā)色/熒光基團(tuán)（如熒光素、試鹵靈和4-甲基傘形酮）的短纖維寡糖來(lái)解決，以獲得更高的靈敏度和定量。但是，將熒光底物用于瓊脂平板的一個(gè)主要限制是其水解產(chǎn)物往往會(huì)大量擴(kuò)散，因此使用這樣的化合物仍然存在困難。因此，在平板法中，人們會(huì)合成新的底物——2-（2'-苯并噻唑基）-苯基[2-（2'-benzothiazolyl）-phenyl，BTP]纖維寡糖來(lái)篩選纖維素分解菌。

現(xiàn)在，研究人員已經(jīng)將重點(diǎn)放在極端環(huán)境中不可培養(yǎng)的微生物的纖維素酶基因上，因?yàn)樗鼈儗?duì)惡劣環(huán)境條件有較高的抵抗力，希望能分離到的酶是新的且在生物煉制工業(yè)中具有特殊的用途。為了快速鑒定從可培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的所有細(xì)菌中分離到的新的纖維素酶，我們應(yīng)該建立宏基因組克隆庫(kù)，然后進(jìn)行功能篩選。

（待續(xù)）