不同自制植物環(huán)保酵素在不同發(fā)酵時間抗氧化力的對比研究

徐德金 陳智松 康天旭 劉佩勇

摘 要 為了對比不同原料的環(huán)保酵素抗氧化力的差異，自制了維生素C和番茄紅素含量較高的8種環(huán)保酵素，分別測定不同濃度不同發(fā)酵時間環(huán)保酵素對羥基自由基、超氧自由基和DPPH自由基的清除能力。結(jié)果表明，8種酵素對各自由基的去除能力差別不大，其中維生素C含量較高的果蔬環(huán)保酵素對3種自由基的清除作用較好，酸棗酵素對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力最好，掐不齊酵素對超氧自由基的清除能力最好。隨著環(huán)保酵素稀釋倍數(shù)的增加，酵素對自由基的清除能力逐漸下降。羥基自由基、超氧自由基和DPPH 自由基的最大去除率分別可達(dá) 98.52%、96.98%和99.77%。為達(dá)到最大去除率，最佳酵素濃度均為原濃度，最佳發(fā)酵時間分別為9個月、3個月和9個月，但時間對清除能力的影響不明顯。

關(guān)鍵詞 環(huán)保酵素；發(fā)酵時間；抗氧化

中圖分類號：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.073

研究表明，酵素具有清除自由基的能力，蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶是其主要的功效酶[1]，因此目前酵素主要用于農(nóng)業(yè)改善土質(zhì)[2]、減少蟲害、增加土壤肥力和醫(yī)藥治療皮膚病、抗炎、抗菌、抗癥等方面[3-10]。近年來，環(huán)保酵素在環(huán)境污染治理方面的研究開始受到關(guān)注，但相關(guān)研究報道幾乎空白。本實驗以家庭中最常見的果蔬作為選材，研究結(jié)果可為日常生活中環(huán)保酵素的使用提供理論依據(jù)，利用這些果蔬制作的酵素或?qū)⑷〈忻嫔弦恍┗瘜W(xué)防腐劑，降低水果腐爛速度，使人體更加健康，同時起到廢物重新利用的功能，促進(jìn)環(huán)保。

1 實驗材料

1.1 儀器和試劑

紫外分光光度計、高速離心機(jī)、水浴鍋、比色皿、小試管、燒杯、量筒。

1.2 實驗材料

酸棗環(huán)保酵素、草莓環(huán)保酵素、掐不齊環(huán)保酵素、獼猴桃環(huán)保酵素、西紅柿環(huán)保酵素、西瓜環(huán)保酵素、番石榴環(huán)保酵素、番木瓜環(huán)保酵素。

2 實驗方法

2.1 環(huán)保酵素制作

分別取酸棗、草莓、掐不齊、獼猴桃、西紅柿、西瓜、番石榴、番木瓜為原料，將質(zhì)量比為1∶3∶10的果蔬材料（切碎）、紅糖、蒸餾水放入不同密封罐中，早期每天放氣一兩次，1個月后待無氣放出置于陰涼處保存3個月。

2.2 檢測方法

通過測量不同環(huán)保酵素在特定條件下的吸光度來計算其對3種自由基（超氧自由基、羥基自由基、DPPH自由基）的清除率，從而判斷其抗氧化能力的強弱。

2.2.1 對羥基自由基的測量方法[2]

在FeSO4、H2O2、水楊酸-乙醇體系中，以水楊酸作為Fenton試劑反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基（-OH）的捕捉劑，在加入不同濃度環(huán)保酵素的情況下，測定酵素對羥基自由基的清除率。

向比色管中加入蒸餾水1.00 mL，1.8 mmol·L-1 FeSO4溶液2.00 mL，1.8 mmol·mL-1水楊酸-乙醇溶液1.50 mL，最后加入0.03% H2O2 0.10 mL，振蕩混合，在波長510 nm處測定其吸光度值A(chǔ)0。另取比色管，向其中加入不同濃度酵素溶液1.00 mL，F(xiàn)eSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加0.03% H2O2 0.10 mL，振蕩混合，水浴37 ℃下保溫30 min后在波長510 nm下測量各自的吸光度值A(chǔ)x，再另取比色管加入相同系列濃度的環(huán)保酵素1.00 mL和FeSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，蒸餾水0.10 mL，在波長510 nm下測量吸光度值A(chǔ)x0。上述三組試管的反應(yīng)同時操作進(jìn)行，以消除時間不均的誤差。

將環(huán)保酵素與FeSO4溶液、水楊酸、乙醇、H2O2混合，37 ℃水浴加熱30 min后在波長510 nm處測定其吸光度值。

羥基自由基清除率計算公式為：

式（1）中，A0為蒸餾水在相同條件下的吸光度值；Ax為添加H2O2的環(huán)保酵素吸光度值；Ax0為未添加H2O2的吸光度值。

2.2.2 對超氧自由基的測量方法[3]

試管中依次加入0.1 mol·L-1 Tris-HCl溶液4.5 mL、雙蒸水4.2 mL，于25 ℃恒溫20 min后加入25 ℃預(yù)熱過的鄰苯三酚（對照管用10 mmol·L-1，鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325 nm處每10 s測定一次吸光值A(chǔ)0，計算ΔA0。

試管中依次加入0.1 mol·L-1 Tris-HCl溶液4.5 mL、雙蒸水3.7 mL、環(huán)保酵素0.5 mL，于25 ℃恒溫20 min后加入25 ℃預(yù)熱過的鄰苯三酚（對照管用10 mmol·L-1，鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325 nm處每10 s測定一次吸光值A(chǔ)SOD，計算ΔASOD。

超氧自由基清除率計算公式為：

式（2）中，ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔASOD：樣品光密度值變化速率。

2.2.3 對DPPH自由基的測量方法[4]

以2 mL蒸餾水+2 mL無水乙醇為空白對照，將2 mL不同濃度酵素液加入到2 mL 20 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液中，混勻后避光處放置30 min后，于波長517 nm處測定吸光度值A(chǔ)i；同法測定2 mL無水乙醇和2 mL不同濃度酵素體系的吸光度值A(chǔ)j，以及2 mL無水乙醇和2 mL

20 mmol·L-1的DPPH乙醇體系的吸光度值A(chǔ)c。

DPPH自由基清除率計算公式為：

式（3）中，Ai為與DPPH-乙醇混合的環(huán)保酵素的吸光度值；Ac為無水乙醇與DPPH-乙醇混合后的溶液的吸光度值；Aj為與無水乙醇混合的環(huán)保酵素的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 同種酵素在不同發(fā)酵時間和不同稀釋度下對羥基自由基的清除情況

圖1和圖2分別表示維生含量高和含番茄紅素高的酵素對羥基自由基的清除率。由圖可知，實驗結(jié)果大體呈現(xiàn)出隨著酵素稀釋度的增加而明顯減少的趨勢，其中酸棗的變化最為規(guī)律，當(dāng)稀釋度≥50時的清除率相差不大，并且原濃度的清除率遠(yuǎn)大于稀釋后的濃度。西瓜對羥基自由基的清除率隨著稀釋度的變化頗為異常，結(jié)果與時間的關(guān)系密切，6月份的清除率最大，其余時間的結(jié)果均過小。清除率隨時間的變化規(guī)律多是先減少后上升，6種酵素在10月的清除率達(dá)到最大，6種酵素在5月的清除率達(dá)到最小。維生素C含量高的酵素普遍變化規(guī)律比較平緩，且自由基清除效果略優(yōu)含番茄紅素高的酵素。

3.2 同種酵素在不同發(fā)酵時間和不同稀釋度下對DPPH自由基的清除情況

圖3和圖4分別表示維生素C含量高和含番茄紅素高的酵素對DPPH自由基的清除率。8種酵素對DPPH自由基的清除率大體呈現(xiàn)出隨著稀釋度的增加而明顯減少的趨勢，并且各稀釋度對應(yīng)的清除率變化幅度較平緩，不同發(fā)酵時間下原濃度的清除率變化相差不大，在稀釋50倍后逐漸出現(xiàn)較大變化，并且有5種酵素在5月的清除率最小，6種酵素在10月的清除率最大。維生素C含量高的酵素對DPPH自由基清除效果基本等同于含番茄紅素高的酵素，但含番茄紅素高的酵素變化規(guī)律普遍平緩一些。

3.3 同種酵素在不同發(fā)酵時間和不同稀釋度下對超氧自由基的清除情況

圖5和圖6分別表示維生素C含量高和含番茄紅素高的酵素對超氧自由基的清除率。以掐不齊為原料的酵素對超氧自由基的清除率大體呈現(xiàn)出隨著稀釋度的增加而明顯減少的趨勢，但是其他酵素的變化趨勢十分異常，維生素C含量高和含番茄紅素高的酵素對超氧自由基的清除率的變化規(guī)律均不明顯。

4 結(jié)論與展望

在原濃度的情況下，環(huán)保酵素對羥基自由基、超氧自由基和DPPH自由基有著良好乃至完全清除作用，且清除能力與原材料關(guān)系不大。由于本實驗的稀釋濃度跨度大，要進(jìn)一步探究環(huán)保酵素的最佳濃度還需要在0.2%～100%進(jìn)行梯度濃度實驗。

本實驗中，維生素C含量較高的果蔬環(huán)保酵素對3種自由基的清除作用較好，酸棗酵素對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力最好，掐不齊酵素對超氧自由基的清除能力最好。隨著環(huán)保酵素稀釋倍數(shù)的增加，酵素對自由基的清除能力逐漸下降，時間對清除能力的影響不明顯，進(jìn)一步實驗需要加長或縮短發(fā)酵周期。

實驗中對環(huán)保酵素稀釋后的對自由基的清除能力進(jìn)行實驗，從原濃度稀釋到50倍后清除能力下降最快，提示實際使用中的稀釋濃度應(yīng)在0～50倍，以免環(huán)保酵素效果過低，最佳的稀釋濃度需要進(jìn)一步實驗，也要考慮實際的需求。

環(huán)保酵素在環(huán)境污染治理方面的研究剛剛起步，可在環(huán)保酵素菌落組成及變化、活性成分分析分離與鑒定、環(huán)保酵素對污水COD、總氮、總磷乃至毒害有機(jī)污染物的清除效果和機(jī)理方面進(jìn)一步開展研究，為后續(xù)環(huán)保酵素在環(huán)境治理方面的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

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（責(zé)任編輯：趙中正）