毛霉發(fā)酵豆粕工藝條件的優(yōu)化

潘進(jìn)權(quán)，劉玉婷，劉夏婷

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江　524048）

毛霉發(fā)酵豆粕工藝條件的優(yōu)化

潘進(jìn)權(quán)，劉玉婷，劉夏婷

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江524048）

為探討豆粕固態(tài)發(fā)酵同步制備多肽及可溶性膳食纖維的工藝條件，選用雅致放射毛霉AS3.2778為發(fā)酵菌株，采用響應(yīng)面分析方法考察了影響發(fā)酵工藝的若干因素，并對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。由此確定了最佳的毛霉固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝條件：豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%木糖、0.3% KH2PO4、0.1%吐溫-80、0.39% CaCl2，含水量52.7%，初始pH 5.68，27 ℃發(fā)酵3 d。在優(yōu)化的工藝條件下，毛霉發(fā)酵豆粕可實(shí)現(xiàn)多肽及可溶性膳食纖維的同步高效轉(zhuǎn)化，其得率分別可達(dá)到16.1%與18.5%。結(jié)果表明毛霉固態(tài)發(fā)酵豆粕同步制備多肽及可溶性膳食纖維的生產(chǎn)工藝具有可行性。

毛霉；豆粕；固態(tài)發(fā)酵；多肽；可溶性膳食纖維

豆粕是大豆經(jīng)榨油后產(chǎn)出的一種副產(chǎn)物，是大豆除去油脂及脂溶性成分后的殘?jiān)?，因保留了大豆中原有的大量營(yíng)養(yǎng)成分，尤其是富含蛋白質(zhì)及膳食纖維等，因此它是一種優(yōu)良的食品加工原料，具有較好的應(yīng)用潛力［1］。然而，豆粕中除含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分外，還共存有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如大豆抗原蛋白、蛋白酶抑制劑及植酸等［2-3］。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子在很大程度上限制了豆粕中有效營(yíng)養(yǎng)成分的利用。因此，關(guān)于豆粕資源的開(kāi)發(fā)利用較多的研究停留在如何解除其抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高其生物利用率方面［4-5］。

已有大量研究表明，大豆蛋白質(zhì)經(jīng)水解制備所得的多肽具有優(yōu)于蛋白質(zhì)及混合氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［6-7］，而且具有一定的生理保健功能，因此大豆多肽已成為保健食品領(lǐng)域的重要功能因子［8-10］。此外，來(lái)源于大豆的大豆膳食纖維，尤其是可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）因具有多重保健意義，已成為眾多保健食品的重要原材料［11-12］。因此，開(kāi)展豆粕向多肽及可溶性膳食纖維的轉(zhuǎn)化研究對(duì)于消除豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕的利用率及附加值有更重要的意義［13-14］。

毛霉因含有豐富的胞外酶系，包含有多種蛋白酶及纖維素酶［15-16］，其在大豆蛋白水解及膳食纖維制備方面已有良好的表現(xiàn)［17-19］，針對(duì)毛霉這一特點(diǎn)，本研究開(kāi)展了毛霉固態(tài)發(fā)酵制備多肽及可溶性膳食纖維的工藝研究，以對(duì)工藝的可行性進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1材料

豆粕湛江渤海農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2菌種與培養(yǎng)基

毛霉（Actinomucor elegans）AS3.2778嶺南師范學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

斜面培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：采用麩皮培養(yǎng)基，每支三角瓶中裝入干麩皮10 g，加水10 mL，攪拌均勻后在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后備用。

豆粕基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：在每支250 mL的三角瓶中裝入干豆粕20 g，加入20 mL水，攪拌均勻滅菌后備用。

1.3方法

1.3.1種子活化

從已活化的試管斜面菌種挑取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)接到麩皮種子培養(yǎng)基上，充分混勻后將其放置在生化培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.3.2毛霉孢子懸浮液的制備

向已培養(yǎng)好的麩皮種子中加入無(wú)菌水100 mL，充分搖勻后用4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾，收集所得的濾液即為毛霉孢子懸浮液。

1.3.3豆粕發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在每支已滅菌后的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1 mL孢子懸浮液，旋搖三角瓶使之充分混勻，然后將三角瓶放置在生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.3.4發(fā)酵豆粕中SDF的提取及得率計(jì)算

SDF的提?。?9］：發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶中發(fā)酵好的豆粕分散在600 mL蒸餾水中（固液比為1∶30（m/V）），調(diào)pH值到4.0，在80 ℃恒溫水浴鍋中加熱120 min，抽濾得到濾液。加入4 倍濾液體積的無(wú)水乙醇，靜置30 min，抽濾，并用80%乙醇洗滌濾渣，所得濾渣即為可溶性膳食纖維。將濾渣置于烘箱中105 ℃烘干至恒質(zhì)量并稱(chēng)質(zhì)量，根據(jù)下式計(jì)算SDF得率。

式中：m1為發(fā)酵豆粕提取得到的可溶性膳食纖維的質(zhì)量/g；m為發(fā)酵豆粕中原干豆粕的質(zhì)量/g。

1.3.5發(fā)酵豆粕中多肽的提取及得率計(jì)算

發(fā)酵豆粕中多肽含量的檢測(cè)參照酸溶蛋白含量的測(cè)定方法［20］，準(zhǔn)確稱(chēng)取發(fā)酵豆粕10 g于100 mL燒杯中，準(zhǔn)確加入15%三氯乙酸溶液50 mL混合均勻，靜置5 min，將提取物轉(zhuǎn)移至離心管，在4 000 r/min離心10 min，其上清液10 mL于消化管中，按半微量凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，即為多肽的含量，根據(jù)下式計(jì)算多肽得率。

式中：m2為發(fā)酵豆粕提取所得多肽的總質(zhì)量/g；m為發(fā)酵豆粕中原干豆粕的質(zhì)量/g。

1.3.6單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)基中成分強(qiáng)化物對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中以干豆粕為基準(zhǔn)分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的碳源（分別為蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的無(wú)機(jī)鹽（分別為ZnSO4、FeSO4、MnSO4、MgCl2、CaCl2、NaCl）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的無(wú)機(jī)鹽（分別為KH2PO4、K2HPO4）及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的吐溫-80，其他成分保持不變，進(jìn)行固體發(fā)酵，由此考察若干成分強(qiáng)化物對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響。

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響：在控制發(fā)酵培養(yǎng)基成分及總含水量不變的前提下，分別調(diào)節(jié)其初始pH值至3.5～8.5的范圍，然后按1.3.3節(jié)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，由此考察培養(yǎng)基初始pH值對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響。

培養(yǎng)基含水量對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響：分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量到35%～80%范圍，然后按1.3.3節(jié)進(jìn)行固體發(fā)酵試驗(yàn)，考察培養(yǎng)基含水量對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響。

發(fā)酵溫度對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響：采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別在18、21、24、27、30、33、36 ℃條件下按1.3.3節(jié)進(jìn)行豆粕發(fā)酵試驗(yàn)，考察發(fā)酵溫度對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響。

1.3.7部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Minitab統(tǒng)計(jì)軟件，采用兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)［21］，對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕有促進(jìn)作用的因素做進(jìn)一步分析，以篩選出對(duì)毛霉發(fā)酵有顯著促進(jìn)作用的若干因素，并初步確定各因素的合適取值范圍。

1.3.8響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)

在部分析因試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件，采用響應(yīng)面分析法中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)［21］，對(duì)部分析因設(shè)計(jì)篩選出的因素做進(jìn)一步優(yōu)化，并由此確定豆粕發(fā)酵制備多肽及可溶性膳食纖維的工藝條件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1發(fā)酵培養(yǎng)基中成分強(qiáng)化物對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的物質(zhì)，考察成分添加物對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響，由此篩選對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕有促進(jìn)作用的物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　成分強(qiáng)化物對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響Table 1 Effects of nutritional supplements on the fermentation of soybean meal by Mucor

由表1可知，原基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的物質(zhì)成分已基本可滿足毛霉菌體的生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶，因此空白對(duì)照樣品中多肽及可溶性膳食纖維的得率均可達(dá)到10%以上；在培養(yǎng)基中添加某些物質(zhì)，如木糖、CaCl2、KH2PO4、吐溫-80對(duì)毛霉發(fā)酵、多肽及可溶性膳食纖維轉(zhuǎn)化有較明顯的促進(jìn)作用；而有些物質(zhì)（如果糖、葡萄糖等）則對(duì)毛霉發(fā)酵表現(xiàn)出抑制作用，這可能是由于這些添加物的存在對(duì)毛霉發(fā)酵產(chǎn)酶表現(xiàn)出了抑制效應(yīng)。通過(guò)試驗(yàn)初步篩選出對(duì)毛霉固體發(fā)酵豆粕有促進(jìn)作用的4 個(gè)物質(zhì)成分：木糖、CaCl2、KH2PO4、吐溫-80。

2.1.2培養(yǎng)基初始pH值對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響

對(duì)于豆粕固態(tài)發(fā)酵制備多肽及膳食纖維的工藝而言，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值既會(huì)影響毛霉菌的正常生長(zhǎng)、產(chǎn)酶效率，同時(shí)也會(huì)影響發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白酶及纖維素酶的穩(wěn)定性及水解效率。由圖1可知，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕有較顯著的影響。毛霉菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶適宜于在偏酸性的環(huán)境；對(duì)于多肽轉(zhuǎn)化而言，適宜的初始pH值范圍在5.0～6.5；對(duì)于可溶性膳食纖維的轉(zhuǎn)化而言，培養(yǎng)基適宜的初始pH值范圍在4.0～5.5；多肽轉(zhuǎn)化與SDF轉(zhuǎn)化所需的最適初始pH值略有不同，這應(yīng)該與這兩類(lèi)酶的分泌及催化適宜條件有關(guān)系。通過(guò)以上試驗(yàn)初步確定毛霉發(fā)酵豆粕的合適培養(yǎng)基初始pH值范圍為4.0～6.5。

圖1　培養(yǎng)基初始pH值對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響Fig.1　Effect of initial medium pH on the fermentation of soybean meal by Mucor

2.1.3培養(yǎng)基含水量對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響

對(duì)于毛霉固體發(fā)酵豆粕轉(zhuǎn)化多肽及膳食纖維的生產(chǎn)工藝而言，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量是一個(gè)重要的影響因素，培養(yǎng)基含水量的高低除了會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)及產(chǎn)酶，同時(shí)它還會(huì)影響培養(yǎng)基中各物質(zhì)的溶解及酶解反應(yīng)，進(jìn)而影響多肽及膳食纖維的轉(zhuǎn)化效率［22-23］。為了確定發(fā)酵培養(yǎng)基的合適含水量，分別于培養(yǎng)基不同含水量的條件下進(jìn)行固體發(fā)酵試驗(yàn)，考察了培養(yǎng)基含水量對(duì)毛霉固體發(fā)酵豆粕的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。培養(yǎng)基含水量對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕確有顯著影響，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量低至35%或是高于65%時(shí)，豆粕中多肽及可溶性膳食纖維的轉(zhuǎn)化得率明顯偏低。通過(guò)以上試驗(yàn)可確定發(fā)酵培養(yǎng)基的合適含水量范圍在40%～60%。

圖2　培養(yǎng)基含水量對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響Fig.2　Effect of water content in the medium on the fermentation of soybean meal by Mucor

2.1.4發(fā)酵溫度對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響

圖3　發(fā)酵溫度對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕的影響Fig.3　Effect of temperature on the fermentation of soybean meal by Mucor

由圖3可知，發(fā)酵溫度對(duì)毛霉生長(zhǎng)及發(fā)酵豆粕有較顯著影響。毛霉是一種典型的適低溫型菌，在相對(duì)較高的溫度下（超過(guò)33 ℃）菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶較困難，從而導(dǎo)致多肽及SDF的得率明顯偏低；而環(huán)境溫度過(guò)低（低于18 ℃）時(shí)，菌體生長(zhǎng)比較緩慢，酶的分泌及催化效率下降，多肽與SDF得率也不高。通過(guò)試驗(yàn)可初步確定毛霉生長(zhǎng)及豆粕發(fā)酵的適宜溫度范圍在24～30 ℃。

2.2部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用部分析因設(shè)計(jì)中的兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)上述篩選的影響因子做進(jìn)一步分析，以確定對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕有顯著促進(jìn)作用的影響因子。表2、3分別給出了部分析因設(shè)計(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果的方差分析。

以多肽與SDF的得率總和（Y）為目標(biāo)，對(duì)部分析因試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。在選取的7 個(gè)因素及各自對(duì)應(yīng)的取值范圍內(nèi)，因素B、E、F對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕有極顯著的影響（P＜0.01）；因素A對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕有顯著的影響（P＜0.05）；此外，曲率分析（表4中Ct Pt項(xiàng)）的結(jié)果則表明，上述因素的二次項(xiàng)對(duì)毛霉發(fā)酵豆粕也有顯著的影響，由這些因素所確定的試驗(yàn)空間是一個(gè)顯著的曲面（P＜0.01），曲面上必然存在極值響應(yīng)點(diǎn)。為了找出這一極值響應(yīng)點(diǎn)及各因素對(duì)應(yīng)的取值，以極顯著性影響因素B、E及F為對(duì)象開(kāi)展了后續(xù)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，與此同時(shí)固定其他因素的取值均為中水平。

表2　部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels used in fractional factorial design

表3　部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3　Fractional f　actorial design scheme and corresponding experimental results　lts

表4　部分析因試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4　Analysis of variance （ANOVA） of the experimental results of fractional factorial design ign

2.3響應(yīng)面分析及優(yōu)化結(jié)果

以部分析因設(shè)計(jì)篩選出的極顯著性影響因素B、E、F為對(duì)象，在上述試驗(yàn)空間內(nèi)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定這3 個(gè)因素的最佳取值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表5　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Central composite design scheme and corresponding experimental results

分別以多肽得率（Y1）、SDF得率（Y2）及總得率（Y）為響應(yīng)值，對(duì)表5的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析可以得到以下數(shù)學(xué)模型：

圖4　培養(yǎng)基初始pHH值?。‥）與含水量（F）對(duì)多肽及SDFF　總得率（Y）的影響Fig.4　Effect of pH （E） and water content （F） in the medium on the total yield of polypeptide and SDF （Y）

方差分析的結(jié)果顯示，回歸模型均有非常高的顯著性（P＜0.01），其R2為0.913 0，說(shuō)明該模型可解釋91.30%的試驗(yàn)結(jié)果。圖4～6給出了模型（5）的響應(yīng)曲面，由圖可見(jiàn)該響應(yīng)曲面是一典型的凸面，在其表面存在最大響應(yīng)點(diǎn)。通過(guò)SAS軟件分析可確定出該曲面的最大響應(yīng)值為Y=（34.27±0.73）%，此時(shí)對(duì)應(yīng)的因素B、E、F的取值分別為CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.39%、pH 5.68、含水量52.7%。

圖5　CaaCCll2質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）與培養(yǎng)基初始ppHH值　（E）對(duì)多肽及SDFF　總得率（Y）的影響Fig.5　Effect of CaCl2（B） and medium pH （E） on the total yield of polypeptide and SDF （Y）

圖6　CaaCCll2質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）與培養(yǎng)基含水量（F）對(duì)多肽及SDFF　總得率（Y）的影響Fig.6　Effect of CaCl2（B） and water content （F） in the medium on the total yield of polypeptide and SDF （Y）

通過(guò)上述優(yōu)化試驗(yàn)可確定出毛霉固體發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件為：豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%木糖、0.3% KH2PO4、0.1%吐溫-80、0.39% CaCl2、含水量52.7%、pH 5.68，在27 ℃發(fā)酵3 d。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行多次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，總得率的平均值為34.6%，結(jié)果與模型的預(yù)測(cè)值相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。在此優(yōu)化的發(fā)酵條件下，多肽與SDF的總得率分別為16.1%、18.5%。

3　結(jié) 論

本研究以開(kāi)發(fā)豆粕中具有高附加值的保健活性物質(zhì)，多肽及可溶性膳食纖維的綜合利用為目標(biāo)，選用具有復(fù)合酶系的毛霉為菌株，擬通過(guò)毛霉固態(tài)發(fā)酵豆粕實(shí)現(xiàn)多肽及可溶性膳食纖維的同步高效轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)探討了毛霉發(fā)酵豆粕轉(zhuǎn)化為多肽及可溶性膳食纖維的生產(chǎn)工藝，并對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了毛霉發(fā)酵豆粕的合適工藝條件為：豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%木糖、0.3% KH2PO4、0.1%吐溫-80、0.39% CaCl2，含水量52.7%，pH 5.68，27 ℃發(fā)酵3 d。在優(yōu)化的工藝條件下，毛霉發(fā)酵豆粕確實(shí)可實(shí)現(xiàn)多肽及可溶性膳食纖維的同步高效轉(zhuǎn)化，兩者的得率分別可達(dá)到16.1%與18.5%，此結(jié)果高于同類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道［24-25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以豆粕為原料通過(guò)毛霉發(fā)酵可顯著提高多肽及可溶性膳食纖維的轉(zhuǎn)化得率，生產(chǎn)工藝具有可行性。

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Optimization of the Fermentation Process of Soybean Meal by Mucor

PAN Jinquan， LIU Yuting， LIU Xiating
（School of Life Science and Technology， Lingnan Normal University， Zhanjiang524048， China）

The production process of polypeptide and soluble dietary fiber （SDF） from soybean meal with solid-state fermentation by Mucor was investigated and optimized with response surface methodology. After optimization， the optimal process conditions were determined as 20 g of soybean meal in a 250 mL shake flask with the addition of 3.0% xylose （g/g soybean meal）， 0.3% KH2PO4， 0.1% Tween-80 and 0.39% CaCl2as the nutrient supplements， initial water content of 52.7%，pH 5.68， fermentation temperature of 27 ℃ and fermentation time of 3 days. Under these conditions， the yield of polypeptide and SDF could reach 16.1% and 18.5%， respectively. The experiment results show that the production process is feasible.

Mucor； soybean meal； solid-state fermentation； polypeptide； soluble dietary fiber

TS201.1

A

1002-6630（2015）23-0178-05

10.7506/spkx1002-6630-201523033

2015-01-12

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA780084）

潘進(jìn)權(quán)（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槊概c發(fā)酵工程。E-mail：pjq78@sina.com