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    云南復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化過程中可培養(yǎng)真菌種群分析

    2018-05-14 09:36:57吳光麗孫瑋宏董高峰王毅宋鵬飛馬永凱魏云林季秀玲李海燕
    中國煙草科學(xué) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:元江醇化彌勒

    吳光麗 孫瑋宏 董高峰 王毅 宋鵬飛 馬永凱 魏云林 季秀玲 李海燕

    摘要:為較全面的了解云南復(fù)烤煙葉在不同地點(diǎn)醇化過程中真菌多樣性,挖掘其中的有益微生物,提高煙草醇化品質(zhì),以復(fù)烤煙葉為試驗(yàn)材料,利用18S rDNA克隆測序技術(shù),系統(tǒng)研究了其醇化過程中可培養(yǎng)真菌的種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,醇化過程中,復(fù)烤煙葉葉面真菌數(shù)量除曲靖倉庫在6月有所上升外,其余各地均隨著醇化的進(jìn)行而逐漸下降,其中曲靖和楚雄兩地非常接近,元江最少;通過形態(tài)特征及18S rDNA鑒定,煙葉葉面真菌包括根霉屬真菌、青霉屬真菌、曲霉屬真菌等24個真菌屬(種)。不同地點(diǎn),不同時(shí)期煙葉葉面真菌的數(shù)量、種類及優(yōu)勢種群不盡相同,而根霉屬真菌始終為優(yōu)勢種群。

    關(guān)鍵詞:復(fù)烤煙葉;醇化;真菌:18S rDNA

    煙葉是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的商品,是卷煙工業(yè)的主要原料。由于當(dāng)年復(fù)烤的煙葉存在刺激性大、青雜氣重、煙氣粗糙、余味澀口、香氣不夠顯露等特點(diǎn),不適宜直接進(jìn)行卷煙生產(chǎn),需經(jīng)過一段時(shí)間的醇化來改善煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性及評吸質(zhì)量,從而達(dá)到生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。在煙葉醇化過程中,微生物及其產(chǎn)生的酶發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用微生物不僅可以通過自身的生命活動作用于煙葉醇化過程,還可通過其代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng),促進(jìn)煙葉中生物大分子的轉(zhuǎn)化。有研究表明,將微生物或酶用于煙葉醇化可縮短醇化時(shí)間,提高煙葉品質(zhì)和改善煙氣特性。相反,如果醇化過程中某類微生物過度繁殖,則會影響煙葉醇化品質(zhì),后續(xù)的卷煙生產(chǎn)及質(zhì)量控制。因此,研究醇化過程中微生物的變化規(guī)律,對調(diào)控微生物作用,提高醇化效率,乃至揭示煙葉醇化機(jī)理具有重要意義。關(guān)于煙葉醇化過程中微生物變化已有不少研究,但關(guān)于復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化其葉面微生物的變化卻鮮有報(bào)道。

    云南是我國煙草原料大省,然而云南立體氣候特點(diǎn)明顯、不同地區(qū)生態(tài)條件差異顯著,勢必影響到微生物群落結(jié)構(gòu)差異,從而對煙葉醇化品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。但目前尚未見關(guān)于云南復(fù)烤煙葉不同地點(diǎn)醇化過程中葉面可培養(yǎng)真菌群落結(jié)構(gòu)的比較研究?;诖耍狙芯繉χ糜趶浝?、曲靖、元江、楚雄4地的紅花大金元復(fù)烤煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量、種類及其動態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究煙葉醇化機(jī)理和人工調(diào)控?zé)熑~醇化進(jìn)程提供依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1供試材料

    本試驗(yàn)所用的煙葉為紅云紅河集團(tuán)及紅塔集團(tuán)2014年的紅花大金元復(fù)烤煙葉,共選取7個樣品進(jìn)行試驗(yàn),分別為昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、紅河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。

    1.2醇化地點(diǎn)及氣候條件

    所有供試紅花大金元(簡稱紅大,HD)復(fù)烤煙葉樣品均分別入庫彌勒、曲靖、元江和楚雄4個倉儲地。彌勒煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為73.3%,曲靖煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為58.2%,元江煙葉倉庫的年平均氣溫24.36℃、濕度為65%,楚雄煙葉倉庫的年平均氣溫20.5℃、濕度為59.6%。

    1.3取樣及真菌分離

    于2015年4、10月:2016年1、7、9月于每個醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17個月的煙草樣品,采用無菌袋(1500 g/袋)密封包裝,每地7個樣,共140個樣品,測定煙葉葉面真菌種類及數(shù)量。

    在無菌條件下,從每個煙葉樣品中隨機(jī)選取50個煙葉片段,然后用無菌剪刀剪成1cmx1cm大小組織塊,并從中隨機(jī)取30個組織塊貼于PDA平板上(10個組織塊/平板,平板直徑為90mm),28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2~55 d,隔天觀察,發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有真菌長出,則將其挑取并轉(zhuǎn)接到新鮮PDA平板上,純化后接于PDA斜面進(jìn)行分類、鑒定及保藏。

    1.4菌株鑒定

    1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長速率、質(zhì)地和分泌物狀態(tài)與顏色等,將分離得到的真菌分為不同的形態(tài)類群(morphotype)之后,從各類群中隨機(jī)挑取3-5株接種于PDA平板上,經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后,通過對孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)與大小、產(chǎn)孢方式與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征來確定菌株的分類地位。對于不產(chǎn)孢的菌株,則進(jìn)行促孢培養(yǎng),產(chǎn)孢后按上述方法進(jìn)行鑒定。對于利用各種方法促孢后仍然不產(chǎn)孢的類群,則依據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、生長速率,菌絲顏色、粗細(xì)和結(jié)構(gòu)等特征劃分為不同的無孢類群組(mycelia sterile)。

    1.4.2分子鑒定

    對于那些不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢后仍不能確定其分類地位的菌株,則通過測定其18S rDNA序列,并與Genebank上的序列比對后,再結(jié)合其形態(tài)特征來確定其分類地位。具體做法為:將供試菌株從斜面轉(zhuǎn)接到PDA平板上進(jìn)行活化,采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)提取菌株基因組DNA。隨后利用真菌ITS通用引物ITSl(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,合格后送碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序。所得序列與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的序列進(jìn)行比對,根據(jù)覆蓋率和相似度并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定其分類地位。

    2結(jié)果

    2.1煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量及其動態(tài)變化

    從彌勒、曲靖、元江、楚雄4個醇化地、5個不同醇化時(shí)間點(diǎn)的140個煙葉樣品的4200個煙葉片段中,共分離得到1636株真菌,其在醇化過程中各醇化地的分布及變化見圖1。由圖1可知,煙葉經(jīng)過一段時(shí)間的醇化后,除曲靖和楚雄兩地在醇化9個月后煙葉葉面真菌數(shù)量非常接近外,各醇化地?zé)熑~葉面真菌數(shù)量差異較大,但總體而言,在各個醇化時(shí)間點(diǎn)都是元江煙葉葉面的真菌數(shù)量低于其他3個醇化地(醇化17個月后略高于彌勒)。且除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個月時(shí)有所上升外,各醇化地?zé)熑~葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時(shí)間的延長而降低。

    2.2煙葉葉面可培養(yǎng)真菌種類及其動態(tài)變化

    如表1所示,本試驗(yàn)共鑒定出真菌24個屬(種),目前仍有4類真菌無法確定其種屬,對于形態(tài)學(xué)難鑒定的菌株,其代表性菌株的分子鑒定結(jié)果見表2。由表1可知,在各個醇化時(shí)間點(diǎn),不同醇化地?zé)熑~葉面真菌的種類各不相同。如醇化6個月時(shí),彌勒煙葉葉面有球毛殼菌(Chaetomium globosum)、Cercophora samala、Myrmaecium rubricosum和小不整球殼屬真菌(Plectosphaerella spp.),但其他3個醇化地?zé)熑~葉面則無:醇化9個月時(shí),楚雄煙葉葉面有青霉屬真菌Penicillium spp.)、Teratosphaeriamolleriana和Coprinops&lagopus,但其他3個醇化地的煙葉葉面則無。

    而同一醇化地在各個醇化時(shí)間點(diǎn),其煙葉葉面真菌的種類也不同。如彌勒煙葉醇化6個月時(shí)出現(xiàn)小不整球殼屬真菌、醇化17個月時(shí)出現(xiàn)Coniochaeta velutina。同樣,曲靖煙葉醇化9個月時(shí)出現(xiàn)小毛克孢屬真菌(Chaetomella spp.)、醇化17個月時(shí)出現(xiàn)枝孢屬真菌(Cladosporium spp.)、球毛殼菌及Chaetomium elatum,而在其他時(shí)期卻未檢測到其存在。

    在醇化剛開始時(shí)(0個月),各樣品中只檢測到根霉屬真菌及黑附球菌,但隨著醇化時(shí)間的延長,根霉屬真菌的數(shù)量不斷減少,其他真菌逐漸出現(xiàn),煙葉葉面真菌種類不斷增加。而4個醇化地在相同的醇化時(shí)間點(diǎn),其煙葉葉面真菌的種類數(shù)目也不同,具體如下:醇化6個月時(shí),彌勒真菌種類>元江>楚雄>曲靖;醇化9個月時(shí),楚雄>彌勒>曲靖>元江:醇化15個月時(shí),元江>彌勒>楚雄和曲靖(兩地一樣多):而醇化17個月時(shí),曲靖>元江>楚雄和彌勒(兩地相同),未呈現(xiàn)任何規(guī)律性。

    2.3不同地點(diǎn)優(yōu)勢菌群及其比例

    不同地點(diǎn)優(yōu)勢菌群及其比例見圖2。隨著醇化時(shí)間的延長,各醇化地的優(yōu)勢菌群不斷發(fā)生變化。如彌勒煙葉醇化0個月及9個月時(shí)優(yōu)勢菌只有根霉屬真菌,所占比例分別為99.2%、96%,醇化6個月時(shí)優(yōu)勢菌有根霉屬真菌和Chaetomium屬真菌,所占比例分別為87%、6.45%,15個月時(shí)有根霉屬真菌、枝孢屬真菌和Sarocladium屬真菌,所占比例分別為74.4%、7%及4.65%,17個月時(shí)有根霉屬真菌和Coniochaeta velutina,所占比例分別為73.7%、10.52%。同樣,元江煙葉醇化0個月、6個月及9個月時(shí)優(yōu)勢菌均只有根霉屬真菌,所占比例分別為99.2%、93.5%及96%,而醇化1 5個月時(shí)有根霉屬真菌、青霉屬真菌、Cercophora屬真菌及枝頂孢霉屬真菌(Acremonium spp.),所占比例分別為20.8%、12.5%、12.5%及12.5%,醇化17個月時(shí),有根霉屬真菌、青霉屬真菌、枝孢屬真菌及鐮刀菌屬真菌(FusaHum spp.),所占比例分別為60.9%,8.7%,8.7%及8.7%。

    各醇化地在相同的醇化時(shí)間點(diǎn),其煙葉葉面真菌優(yōu)勢菌群不同,但根霉屬真菌始終是各醇化地、各醇化時(shí)間點(diǎn)的絕對優(yōu)勢類群。而青霉屬真菌、曲霉屬真菌、鐮刀菌屬真菌、屬真菌、Myrmaecium rubricosum和枝孢屬真菌在煙葉醇化過程中也十分普遍,但不同醇化地、不同醇化時(shí)間點(diǎn)其優(yōu)勢各異。

    3討論

    本研究發(fā)現(xiàn)云南復(fù)烤煙葉(紅大)在醇化6個月后,云南楚雄和曲靖兩地?zé)熑~葉面真菌數(shù)量非常接近,與彌勒和元江存在較大差異??傮w而言,元江醇化煙葉葉面真菌數(shù)量最少。除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個月時(shí)有所上升外,各醇化地葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時(shí)間的延長而降低。醇化過程中4地?zé)熑~葉面真菌數(shù)量、種類及優(yōu)勢菌群不同,可能與楚雄、彌勒、曲靖、元江4個醇化地的環(huán)境差異(年均溫、濕度等)有關(guān):曲靖和楚雄年均溫濕度比較接近,與彌勒及元江差異較大,彌勒年均濕度最高,高達(dá)到73.3%,元江年均溫度最高,高達(dá)24.4℃。這與以往的報(bào)道一致,即醇化煙葉葉面微生物的數(shù)量和種類與發(fā)酵條件密切相關(guān)。而隨著醇化的進(jìn)行,真菌數(shù)量不斷減少、種類及優(yōu)勢菌群不斷發(fā)生變化,可能與醇化時(shí)間有關(guān)。醇化初期煙葉葉面營養(yǎng)物質(zhì)豐富,葉面殘留及環(huán)境中的微生物在葉面大量生長,葉面微生物數(shù)量較多,隨著醇化的進(jìn)行,煙葉含水量降低,葉面營養(yǎng)物質(zhì)減少,微生物生長受限,且微生物間存在拮抗作用,相互抑制而使其數(shù)量逐漸減少,種類及優(yōu)勢菌群也不斷發(fā)生變化。楊金奎等也發(fā)現(xiàn)醇化煙葉表面可培養(yǎng)微生物的數(shù)量隨著醇化時(shí)間的延長呈明顯的下降趨勢,而種類也在不斷變化。同樣,韓錦峰等、段焰青等、趙銘欽等及朱大恒等也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。

    根霉屬真菌是本研究中的絕對優(yōu)勢菌群。余玉莎等發(fā)現(xiàn)米根霉TZK-1能夠發(fā)酵煙末增加煙葉致香成分,同時(shí),在煙葉醇化過程中,根霉屬真菌也有可能引起煙葉霉變。因此,本研究表明,根霉屬真菌在云南彌勒、曲靖、元江、楚雄4個煙葉醇化地的各個醇化時(shí)期均為優(yōu)勢菌群之一,其數(shù)量及動態(tài)變化在云南紅大煙葉醇化品質(zhì)方面應(yīng)該發(fā)揮著極其重要的作用,值得進(jìn)一步深入研究。

    4結(jié)論

    本研究表明,醇化過程中,不同醇化地?zé)熑~葉面真菌數(shù)量均隨著醇化時(shí)間的延長而不斷下降,而真菌種類有所增加。不同醇化地點(diǎn)同一醇化時(shí)間及同一醇化地點(diǎn)不同醇化時(shí)間,其煙葉葉面真菌數(shù)量、種類及優(yōu)勢菌群不同。根霉屬真菌在各醇化時(shí)期及各醇化地均為優(yōu)勢菌群,前期占比90%以上:隨著醇化時(shí)間延長,青霉屬真菌、枝孢屬真菌及Chaetomium屬真菌等種類出現(xiàn)且比例有所增加。微生物數(shù)量及動態(tài)變化在云南紅大煙葉醇化品質(zhì)方面的作用值得進(jìn)一步深入研究。

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