實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)甲型H1N1流感病毒

谷宇佳

[摘要] 目的 對(duì)疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者的標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸確診，進(jìn)而探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在甲型H1N1流感病毒檢測(cè)診斷中的意義。方法 選取2017年9—12月某院檢驗(yàn)科工作人員采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行病毒核酸確診檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒以及乙型流感病毒進(jìn)行臨床分型。結(jié)果 該組標(biāo)本中檢出甲型H1N1流感病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本108份，檢出率為108/330（32.73%），檢出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未檢出乙型流感病毒。結(jié)論 臨床上診斷甲型H1N1流感病毒時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，此種技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、有著較強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度。有著較高的應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)；檢測(cè)；甲型H1N1流感病毒

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2018）11（a）-0035-02

甲型H1N1流感病毒是一種甲型流感病毒，臨床上對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，傳統(tǒng)的方法是以細(xì)胞培養(yǎng)或者雞胚培養(yǎng)分離定型流感病毒，但是這些方法都需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，尤其滿足不了暴發(fā)疫情時(shí)，對(duì)病毒的診斷需求。近些年，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛的應(yīng)用在了檢測(cè)甲型H1N1流感病毒的臨床上，此種技術(shù)操作起來(lái)極其簡(jiǎn)單快捷，并且其靈敏度和自動(dòng)化的程度比較高，加上對(duì)核酸有著較高的擴(kuò)增性，能夠?qū)仔虷1N1流感病毒做出快速的檢測(cè)[1]。為了對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在甲型H1N1流感病毒檢測(cè)診斷中的意義進(jìn)行更加深入的探討，2017年9—12月該文選取了330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行病毒核酸確診檢測(cè)后，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了臨床分型?，F(xiàn)對(duì)詳細(xì)內(nèi)容做如下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本的采集和處理

選取某院檢驗(yàn)科工作人員采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標(biāo)本，其中包括某院兒科門(mén)診、內(nèi)科門(mén)診、以及呼吸科病房中發(fā)熱伴咳嗽、咽痛等疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者的咽拭子標(biāo)本。該次研究中涉及到的標(biāo)本的采集、存儲(chǔ)、運(yùn)輸?shù)雀黜?xiàng)操作均以《甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案（試行）》文件為依據(jù)進(jìn)行執(zhí)行，將采集到的標(biāo)準(zhǔn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)人員要在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)，對(duì)于來(lái)不及檢測(cè)的標(biāo)本，應(yīng)將其放置在-70℃的環(huán)境下進(jìn)行凍存。

1.2 儀器與試劑

該次研究中用到的儀器為Ⅱ級(jí)生物安全柜（生產(chǎn)企業(yè)：美國(guó)NuAire NU公司；型號(hào)：425-400E）；冷凍離心機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)：美國(guó)貝克曼Microfuge公司；型號(hào)：22R）；全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（生產(chǎn)企業(yè)：美國(guó)ABI公司；型號(hào)7500 fast）；旋渦振蕩器（生產(chǎn)企業(yè)：德國(guó)Heidolph公司）；核酸提取盒【生產(chǎn)企業(yè)：德國(guó)QIAGEN公司；型號(hào)：RNeasy Mini Kit】；無(wú)核酸離心管；甲型H1N1流感病毒（2009）RNA檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：北京金豪公司）。

1.3 對(duì)標(biāo)本中的病毒進(jìn)行提取

采用核酸提取盒對(duì)標(biāo)本中的病毒RNA進(jìn)行提取，提取操作嚴(yán)格按照試劑盒中的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 反應(yīng)的體系以及條件

采用甲型H1N1流感病毒（2009）RNA檢測(cè)試劑盒。反應(yīng)體系包括：SWH1反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄酶，注意所有反應(yīng)體系的配置情況均以試劑的說(shuō)明書(shū)為依據(jù)進(jìn)行。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄以變性為，在50℃下進(jìn)行30 min，然后在95℃下進(jìn)行3 min，按照次順序進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，預(yù)擴(kuò)增為在95℃下進(jìn)行15 s，然后在50℃下進(jìn)行30 s，在72℃下進(jìn)行1 min，按照此順序進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，再在95℃下進(jìn)行10 s，在55℃下進(jìn)行40 s，按照此順序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后為熒光收集，選取FAM信道在55℃的環(huán)境下進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR技術(shù)的特異性與敏感性

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)甲1型流感病毒、甲3型流感病毒以及乙型流感病毒的RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，這樣也能夠排除甲型H1N1流感病毒的可能性。對(duì)本院檢驗(yàn)科人員所提取的甲型H1N1流感病毒RNA的檢測(cè)過(guò)程中，特異性引物和探針對(duì)檢測(cè)結(jié)果起到了輔助性的作用。

2.2 對(duì)疑似流感標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

該組標(biāo)本中檢出甲型H1N1流感病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本108份，檢出率為108/330（32.73%），檢出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未檢出乙型流感病毒。詳見(jiàn)表1。

對(duì)該次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，甲型H1N1流感病毒陽(yáng)性率逐漸降低，疫情基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，并且越進(jìn)入冬季，所檢測(cè)出來(lái)的流感樣病理基本都是甲型H1N1流感病毒。

3 討論

定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)是美國(guó)Applied Biosystems公司在1996年研發(fā)出來(lái)的一種新技術(shù)，此種技術(shù)不但能夠解決PCR污染的問(wèn)題，還具有較高的自動(dòng)化程度以及較強(qiáng)的特異性[2]。采用此種技術(shù)對(duì)甲型H1N1流感病毒進(jìn)行檢測(cè)診斷時(shí)，由于將實(shí)時(shí)PCR技術(shù)與逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)結(jié)合了起來(lái)，因此被叫做定量“RT-PCR”技術(shù)。結(jié)合起來(lái)的這種技術(shù)能夠用少量的RNA識(shí)別出在某個(gè)特定時(shí)間、細(xì)胞以組織內(nèi)的特定基因，將此種技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)甲型H1N1流感病毒檢測(cè)診斷的臨床上，為提高診斷準(zhǔn)確性提供了可靠的依據(jù)[3]。

根據(jù)國(guó)家對(duì)甲型H1N1流感病毒檢測(cè)診斷的標(biāo)準(zhǔn)以及處理原則，對(duì)流行性感冒病原學(xué)常規(guī)的檢測(cè)方法為病毒培養(yǎng)法，這種方法雖然也有著較高的診斷準(zhǔn)確率，但是確診時(shí)間一般在15～20 d，并且還會(huì)受到實(shí)驗(yàn)室條件和人員條件的限制。而定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)法不但靈敏度高，操作方便，最主要的是耗時(shí)短，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需要3～4 h就可以完成，尤其在甲型H1N1流感病毒爆發(fā)的季節(jié)，此種方法是最為有效的檢測(cè)手段[4]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)起始模板定量以及定性的分析，在這個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中，將熒光化學(xué)物質(zhì)引入其中，熒光強(qiáng)度的信號(hào)會(huì)隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸加強(qiáng)，此時(shí)所監(jiān)測(cè)到的信號(hào)就可以繪制成一條曲線，然后對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。在實(shí)際檢測(cè)的過(guò)程中，既有特異性引物存在，還有核苷酸探針存在，其目的都是在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，利用聚合酶的活性將探針進(jìn)行水解，使其水解成單核苷酸，此時(shí)有力的熒光報(bào)告基因?qū)е碌臒晒庑盘?hào)的增加，就會(huì)通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量的分析[5]。

該次研究中，選取了2017年9—12月某院檢驗(yàn)科工作人員采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標(biāo)本，采用定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行病毒核酸確診檢測(cè)后結(jié)果顯示，該組標(biāo)本中檢出甲型H1N1流感病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本108份，檢出率為108/330（32.73%），檢出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未檢出乙型流感病毒。并且在進(jìn)入11月份和12月份后，甲型H1N1流感病毒的檢出率逐漸降低。在9月份開(kāi)始，各學(xué)校已經(jīng)開(kāi)學(xué)，這種聚集性的環(huán)境非常有利于甲型H1N1流感病毒的傳播和擴(kuò)散，進(jìn)入11月后，氣溫逐漸轉(zhuǎn)變涼，甲型H1N1流感病毒的陽(yáng)性率逐漸下降，這可能是由于進(jìn)入冬季后，人們的個(gè)人預(yù)防意識(shí)增強(qiáng)，加上甲型H1N1流感病毒疫苗的廣泛注射，陽(yáng)性率有所降低。

綜上所述，臨床上診斷甲型H1N1流感病毒時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，此種技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、有著較強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度，建議將此種檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用在更多的臨床上。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 紀(jì)衍瑾，孫雯雯，朱喆.定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速檢測(cè)甲型H1N1流感病毒[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2015，27（17）：61-62.

[2] 方盛藩，鄭夔，李小波，等.甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的構(gòu)建[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015， 25（1）：1-3.

[3] 尹航，楊煥良，陳艷，等.甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：36-39.

[4] 陳棋炯，孫永祥，丁水軍，等.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)甲型H1N1流感病毒[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（6）：1394-1396.

[5] 尹惠瓊，劉松婷，史利軍，等.甲型H1N1流感病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（2）：244-247.

（收稿日期：2018-08-01）