一種新的豇豆根腐病病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

張河慶 席亞東 陳玲 向娟 韓帥 吳婕

摘要 本文對(duì)四川成都發(fā)生的豇豆根腐病病原菌進(jìn)行鑒定，為豇豆根腐病的藥劑防治提供依據(jù)。采集了成都市豇豆種植區(qū)豇豆根腐病病株，經(jīng)常規(guī)組織分離并純化獲得116株分離菌株，對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定及rDNA-ITS序列分析。結(jié)果表明，分離到的鐮孢菌中有10株為Fusarium commune，分離頻率為8.62%。對(duì)該10株菌進(jìn)行致病性測定，均為致病菌株；其中MW4-11菌株致病性最強(qiáng)。該致病菌株的最適生長溫度為25～30℃，菌絲致死溫度為70℃。選用7種殺菌劑通過平皿培養(yǎng)法對(duì)MW4-11菌株進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑對(duì)該致病菌株的毒性最強(qiáng)，EC50為0.030 μg/mL。

關(guān)鍵詞 豇豆； 根腐??； 鐮孢菌； Fusarium commune

中圖分類號(hào)： S 436.43

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017221

Abstract This paper aims to identify the pathogen of cowpea root rot， and provide reference for the control of the disease. Totally 116 isolates collected from diseased plants in Chengdu City were identified based on pathogenicity test， morphological characteristics and ITS rDNA sequence analysis. Of which 10 isolates belong to Fusarium commune， accounting for 8.62%. Pathogenicity assays indicated that these Fusarium commune isolates were pathogenic to cowpea， and the most pathogenic strain was MW4-11. The mycelial growth test on MW4-11 indicated that the optimal temperature range for the mycelial growth was 25-30℃ and the lethal temperature was 70℃. Toxicities of 7 fungicides were tested by petri dish cultivation method. The results showed that trifloxystrobin · tebuconazole 75% WG had the highest toxicity to F.commune MW4-11， with the EC50 values of 0.030 μg/mL.

Key words cowpea； root rot； Fusarium； Fusarium commune

豇豆Vigna unguiculata （L.） Walp.是我國普遍栽培的蔬菜之一，全國常年栽培面積在33萬hm2以上，四川省栽培面積在1萬hm2以上[1]。豇豆鐮孢型根腐病是重要的土傳病害之一，在我國豇豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，田間病株率為10%～100%。在田間可以與絲核菌根腐病、疫霉根腐病等形成病害復(fù)合體，造成更大的危害[2]。

豇豆根腐有鐮孢型根腐、疫霉型根腐、腐霉型根腐、絲核菌型根腐等。吳仁峰等分離鑒定湖北武漢地區(qū)豇豆根腐病原菌為茄鐮孢Fusarium solani[3]；楊玉潔等人認(rèn)為江蘇省如皋市豇豆根腐病原菌主要有茄鐮孢F.solani、尖鐮孢F.oxysporum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[4]；幾內(nèi)亞、印度、中非、尼日利亞等地的豇豆根腐病病原菌為瓜果腐霉Pythium aphanidermatum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[58]；印度豇豆根腐病病原菌主要為菜豆殼球孢菌Macrophomina phaseolina[9]。目前，還未見Fusarium commune侵染豇豆引起根腐病的報(bào)道。鐮孢菌能夠以厚垣孢子的形式在土壤中存活10年以上，在離開寄主的情況下也能存活5～6年[10]。因此，對(duì)該病的防治非常困難。

本研究對(duì)引起成都地區(qū)豇豆根腐病的病原菌進(jìn)行分離鑒定，以明確引起成都豇豆根腐病的病原種類，并針對(duì)該病菌進(jìn)行室內(nèi)防治藥劑篩選，旨在為成都地區(qū)豇豆根腐病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源與病原菌的分離純化

病樣于2016年采自成都市的豇豆主產(chǎn)區(qū)。病原真菌的分離方法參照方中達(dá)[11]的《植病研究方法》。選取新發(fā)病豇豆植株莖基部的根莖作為分離材料，進(jìn)行常規(guī)組織分離，經(jīng)單孢純化、培養(yǎng)獲得單孢菌株，并于4℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基上保存。

1.2 致病性測定

采用Kochs Rules進(jìn)行分離菌株的致病性測定。將分離到的菌株用PDA培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中，于28℃，160 r/min搖床上培養(yǎng)3～5 d，然后將病菌純培養(yǎng)物（孢子）制成濃度為106～107個(gè)/mL懸浮液。采用自然傷根浸根法接種。取生長良好的無病‘贛蔬領(lǐng)袖豇豆苗（江西金浩種業(yè)有限公司生產(chǎn)），用清水將根部表面沖洗干凈后將根部完全浸在孢子懸浮液中30 min，接種后的植株定植于裝有無菌泥炭土的營養(yǎng)杯中。每個(gè)菌株接種10株苗，以清水為對(duì)照。植株置于25℃下植物培養(yǎng)箱中，接種后每隔1～2 d觀察1次。發(fā)病后，從病斑處再次分離病原菌，確認(rèn)致病菌。

接種15 d后調(diào)查豇豆的發(fā)病率和病情指數(shù)，所得數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行匯總，利用SPSS 16.0軟件的Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。根據(jù)發(fā)病率和病情指數(shù)挑選致病性強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

豇豆根腐病分級(jí)方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T17980.882004農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（二）第88部分《殺菌劑防治大豆根腐病》。

0：植株莖基部和主根均無病斑；

1：莖基部和主根上有少量病斑；

3：莖基部和主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1/4～1/2；

5：莖基部及主根上病斑多且大，病斑面積占莖基部和根部總面積的1/2以上～3/4；

7：莖基部或主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未死亡；

9：根系壞死，植株地上部分萎蔫或死亡。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×該級(jí)代表值）×100/（調(diào)查總株數(shù)×病情最高級(jí)代表值）；

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將供試的致病菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，72 h后使用十字交叉法測定菌落的生長速率。7 d后觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征。在SNA培養(yǎng)基上觀察分生孢子梗、大小分生孢子和厚垣孢子的特征，并隨機(jī)測量20個(gè)分生孢子的大小。

根據(jù)菌落形態(tài)、生長速度和色素顏色，大、小型分生孢子的特征，厚垣孢子有無和著生位置等特征，參照Skovgaard等的報(bào)道[12]，并結(jié)合Leslie等[13]的鐮孢菌實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)進(jìn)行病原菌種的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 溫度對(duì)致病菌株生長的影響

選取致病性強(qiáng)的菌株MW4-11于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d，用7 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、30 、35和40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.5 菌絲致死溫度測定

選取致病性強(qiáng)的菌株MW4-11于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)5 d，用7 mm打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊并置于無菌試管中，加入2 mL無菌水。分別在35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴鍋中處理10 min 后取出迅速冷卻，將菌絲塊取出置于PDA平板上25℃恒溫培養(yǎng)，5 d后觀察菌絲生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)4次。

1.6 病原菌rDNA-ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.6.1 菌絲制備

將保存的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，每皿接種一個(gè)菌絲塊，于25℃暗培養(yǎng)7 d后用滅菌的載玻片刮取菌絲，并用液氮冷凍研磨成粉，置于-80℃保存，用于基因組DNA提取。

1.6.2 基因組DNA提取

基因組DNA采用改良的CTAB法提取[14]，然后用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCC-TCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所得擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序，得到ITS序列，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST功能搜索相似度較高的ITS序列。選擇測序獲得的序列以及GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列，運(yùn)行Clustal W程序進(jìn)行序列比對(duì)。再運(yùn)用軟件MEGA 6.0，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 不同殺菌劑對(duì)豇豆根腐病病原菌的室內(nèi)毒力

1.7.1 供試藥劑

75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑，德國拜耳作物科學(xué)公司；50%醚菌酯水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；50% 烯酰嗎啉水分散粒劑，北京達(dá)世豐生物科技有限公司；16%二氰·吡唑酯水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；22.5%啶氧菌酯懸浮劑，美國杜邦公司；100 g/L氰霜唑懸浮劑，日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；30%噁霉靈水劑，四川國光農(nóng)化股份有限公司。

1.7.2 含藥平板制備

各供試藥劑的濃度梯度見表1。濃度1為廠家推薦濃度。先將供試藥劑稀釋成相應(yīng)系列濃度的10倍，然后按藥液與培養(yǎng)基1∶9的比例，將藥液加入到熔化的培養(yǎng)基中，制成含藥平板，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.7.3 測定方法

用打孔器在培養(yǎng)5 d的病原菌菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，分別放在不同藥劑平板中央，菌絲面朝下，以加入等量無菌水的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照；在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，6 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算殺菌劑對(duì)菌絲生長的抑制率，并用DPS數(shù)據(jù)分析軟件求EC50，比較供試藥劑的毒力大小。

抑制率=（空白對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（空白對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與培養(yǎng)

從采自成都市豇豆產(chǎn)區(qū)的豇豆根腐病樣品中共分離到116株鐮孢菌，其中有10株初步定為F.commune （菌株編號(hào)為：MW4-11，MW4-12， MW1-12，MS1-31，MS1-32，CY28411，CY28412，CY28413，PZ10.11，PZ10.12），分離頻率為8.62%。

2.2 致病性測定

用2.1初步確定的10株F.commune的分生孢子懸浮液接種自然傷根的豇豆植株，結(jié)果表明，接種后豇豆植株均能發(fā)病。發(fā)病初期，植株葉片沒有明顯變化，植株生長緩慢；發(fā)病中期植株出現(xiàn)倒伏萎蔫，葉脈黃化，拔出植株，可見其根部自根尖開始發(fā)生病變，由側(cè)根延及主根，致整個(gè)根系壞死腐爛，并可延及根莖部，對(duì)照均不發(fā)?。▓D1）。從病斑處再次分離得到的菌株其性狀均與原菌株相同。致病性測定表明（表2）10株F.commune均為致病病原菌，其中MW4-11菌株接種后植株易發(fā)病，致病性最強(qiáng)，植株發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為84.57±0.62，顯著高于其他分離菌株，因此選取MW4-11菌株作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

2.3 病原菌形態(tài)特征

選取致病性最強(qiáng)的菌株MW4-11在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)72 h菌落直徑為4.3 cm。菌落生長較快，氣生菌絲發(fā)達(dá)，為白色絨毛狀，培養(yǎng)基背面的色素從無色到乳白色，之后顏色隨培養(yǎng)時(shí)間的延長變?yōu)榈S色，（圖2a～b）。在SNA培養(yǎng)基上，小型分生孢子數(shù)量較多，橢圓形至棍棒形，通常無隔膜，大小為（3.5～10.1）μm×（2.2～3.5）μm（圖2c）；大型分生孢子較少，細(xì)長，梭形兩端略彎，有1～3個(gè)分隔，3個(gè)分隔居多，頂細(xì)胞彎曲或收縮變尖，足細(xì)胞足形或收縮呈點(diǎn)，大?。?2.1～39）μm×（3.5～3.8）μm（圖2d）；產(chǎn)孢細(xì)胞為短單瓶梗（圖2f），偶有較長的單瓶梗（圖2e）；厚垣孢子單生（圖2g）。參照Skovgaard等[12]的報(bào)道，結(jié)合Leslie等[13]的分類系統(tǒng)，將該菌鑒定為Fusarium commune。

2.4 溫度對(duì)MW4-11菌株生長的影響

圖3為MW4-11致病菌株在不同溫度條件下培養(yǎng)3 d的生長情況，表明菌絲最適生長溫度為20～25℃；在10～35℃條件下均可生長，在5℃和40℃條件下幾乎不能生長。

2.5 MW4-11致病菌株的致死溫度

由菌絲致死溫度的測定結(jié)果（圖4）可知，菌落直徑隨處理溫度升高有降低趨勢。65℃及以下水浴處理10 min后的菌絲均能在PDA培養(yǎng)基上再生長，而70℃水浴處理10 min后所有重復(fù)處理均無菌絲生長。說明MW4-11菌株致死溫度為70℃（10 min）。

2.6 病原菌rDNA-ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

在形態(tài)學(xué)上，Skovgaard等和Yu等認(rèn)為Fusarium commune與尖鐮孢非常相似很難區(qū)分，需用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定[12，15]。本文以ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）與ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物對(duì)10株病原菌的ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示10株病原菌的ITS序列與GenBank中的Fusarium commune （GenBank登錄號(hào)為：KU341323.1， KT98228.1， KU341323.1）的相應(yīng)片段相似度均達(dá)到99%以上，E-value值為0.0。運(yùn)用MEGA 6.0軟件，根據(jù)Kimura2-parameter模型，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），bootstrap自展重復(fù)1 000次計(jì)算系統(tǒng)樹種的置信度。結(jié)果顯示，10株病原菌與F.commune在同一分支上，因此將該10株病原菌鑒定為F.commune。

2.7 殺菌劑毒力測定結(jié)果

選取致病性最強(qiáng)的Fusarium commune菌株MW4-11測定供試殺菌劑對(duì)其的毒力。據(jù)試驗(yàn)結(jié)果（表3）可知，7種殺菌劑對(duì)MW4-11菌株均有抑制作用。其中75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑的抑菌效果最好，最高濃度下抑制率為94.55%，EC50為0.030 μg/mL；30%噁霉靈水劑、16%二氰·吡唑酯水分散粒劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑和50%烯酰嗎啉水分散粒劑的抑菌效果次之，最高濃度下抑制率分別為83.21%、80.9%、71.18%、67.99%，EC50分別為19.498、69.158、24.805、79.549 μg/mL； 100 g/L氰霜唑懸浮劑和50%醚菌酯水分散粒劑的抑菌效果差，50%醚菌酯水分散粒劑最高濃度下抑制率僅為49.92%，且EC50高達(dá)211.170 μg/mL；雖然100 g/L氰霜唑懸浮劑在最高濃度下抑制率較高，但EC50也最大，為2 059.054 μg/mL。

3 討論

形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果表明，分離到的116株鐮孢菌中，有10株為Fusarium commune，分離頻率為8.62%。致病力測定結(jié)果表明，接種MW4-11菌株的豇豆發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為84.57±0.62， MW4-11菌株屬于強(qiáng)致病菌。

已有研究表明，鐮孢屬真菌是引起豇豆根腐病的重要病原菌，其中茄鐮孢被認(rèn)為是豇豆鐮孢型根腐的主要病原菌[3，16]，Shrestha等報(bào)道層生鐮孢也可以引起豇豆根腐[17]；而本研究發(fā)現(xiàn)Fusarium commune對(duì)豇豆有強(qiáng)的致病力，也能夠引發(fā)豇豆根腐病。

2003年Skovgaard等首次將Fusarium commune作為一個(gè)新種來描述，F(xiàn).commune的形態(tài)特征與F.oxysporum非常相似，而且該菌在2003年之前一直被鑒定為F.oxysporum。這兩種菌都能從短的單瓶梗上產(chǎn)生分生孢子，且厚垣孢子為單生或?qū)ι?。唯一能夠區(qū)分這兩種菌的形態(tài)特征是F.commune存在細(xì)長的單瓶梗，偶爾會(huì)出現(xiàn)多瓶梗[12]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn).commune能夠引起美國白松、黃杉、康乃馨、玉米、胡蘿卜、大麥和山葵根腐病[12，15]，也能夠引起番茄的冠腐病和根腐病[18]。Fusarium commune作為豇豆根腐病的病原菌是首次報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)引起豇豆根腐病的病原菌MW4-11菌株進(jìn)行最適生長溫度和致死溫度的研究，結(jié)果表明，該菌最適生長溫度為20～25℃，在5℃以下、40℃以上幾乎不生長，該菌生長規(guī)律與尖鐮孢大體一致[19]。該菌菌絲致死溫度為70℃（10 min），鄭莉等報(bào)道草莓枯萎病菌Fusarium oxysporum Schl.菌絲生長的致死溫度為65℃（10 min）[20]，賀春萍等研究發(fā)現(xiàn)，西瓜尖鐮孢Fusarium oxysporum f.sp.niveum（E. F Smith）Snyder & Hansen菌絲的致死溫度為80℃（10 min）[21]。說明Fusarium commune 與尖鐮孢以及尖鐮孢不同?；椭g菌絲生長對(duì)溫度的敏感性存在差異。

為了篩選抑制Fusarium commune生長的化學(xué)藥劑，為防治Fusarium commune引起的根腐病提供依據(jù)，我們測定了7種殺菌劑對(duì)MW4-11菌株的室內(nèi)毒力，結(jié)果（表3）表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑對(duì)該病菌菌絲生長的抑菌效果最好，最高濃度下抑制率為94.55%，EC50為0.030 μg/mL，其次為30%噁霉靈水劑、16%二氰·吡唑酯水分散粒劑、22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%烯酰嗎啉水分散粒劑，它們均可作為豇豆根腐病防治的候選藥劑。豇豆根腐病的傳統(tǒng)防治藥劑為噁霉靈，而本研究結(jié)果表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑對(duì)豇豆根腐病病原菌的生長抑制效果好于30%噁霉靈水劑；22.5%啶氧菌酯懸浮劑對(duì)豇豆根腐病病原菌的生長抑制效果與30%噁霉靈水劑的相當(dāng)。本研究拓寬了防治豇豆根腐病的藥劑選擇范圍，為豇豆根腐病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）